隨著疫情進(jìn)入攻堅(jiān)階段，基于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法的核酸檢測(cè)技術(shù)在新冠病毒快速鑒定及確診中發(fā)揮了重要作用。然而，若要對(duì)新冠病毒來(lái)源、變異進(jìn)化及致病機(jī)理等進(jìn)行研究，需獲取完整的病毒基因組信息，這離不開(kāi)高通量測(cè)序和病毒序列組裝。

為全面深入地揭示新冠病毒的相關(guān)特性，華大智造可為新型冠狀病毒高通量測(cè)序、序列組裝、變異進(jìn)化分析等流程提供一體化產(chǎn)品組合，并已協(xié)助全國(guó)多地疾控中心成功組裝新型冠狀病毒全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示，它們與公布的參考基因組序列高度一致。

新冠病毒序列組裝過(guò)程中的難點(diǎn)及要求

如大家所知，高通量測(cè)序在新冠病毒鑒定及診斷中可與RT-PCR法形成互補(bǔ)，不僅能提高陽(yáng)性檢出率，還能進(jìn)行并發(fā)檢測(cè)，提供更多可能感染的病原信息。更為重要的是，它還可以對(duì)病毒序列進(jìn)行組裝，獲得病毒全長(zhǎng)基因組信息，為追溯病毒來(lái)源、監(jiān)測(cè)病毒變異趨勢(shì)、探究致病機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。

為獲取完整的病毒基因組序列，目前廣泛應(yīng)用的高通量測(cè)序技術(shù)是將核酸序列打斷成短片段進(jìn)行測(cè)序，然后通過(guò)分析軟件將測(cè)得的短序列進(jìn)行拼接組裝。然而，新型冠狀病毒作為一種新發(fā)病毒，人們?cè)跍y(cè)序深度、測(cè)序準(zhǔn)確性、重復(fù)序列比例等方面，還沒(méi)有形成具有參考意義的經(jīng)驗(yàn)值。如果要將海量的短序列還原出原始的基因組序列，則會(huì)在序列拼接中出現(xiàn)以下問(wèn)題：

首先，難免出現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤，導(dǎo)致某些重疊可信度低；其次，基因組序列的不完全覆蓋性以及高重復(fù)序列的干擾，會(huì)影響拼接的準(zhǔn)確性和完整性；最后，宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本中的人源序列占85%以上，病原序列僅占5%左右，這使得病毒基因組序列拼接難度更高。

圖1 序列拼接組裝難點(diǎn)及其對(duì)測(cè)序產(chǎn)品的要求

優(yōu)化測(cè)序策略，確保病毒序列信息完整性

為破解上述新冠病毒序列在組裝過(guò)程中遇到的難題，華大智造可提供含建庫(kù)、高通量測(cè)序、序列組裝、變異進(jìn)化分析等流程在內(nèi)的一體化產(chǎn)品組合。

在建庫(kù)環(huán)節(jié)中，為避免樣本在采樣、保存和運(yùn)輸過(guò)程中因不確定性導(dǎo)致提取的核酸含量出現(xiàn)較大差異，華大智造可提供兩種產(chǎn)品組合：一是對(duì)核酸含量高的樣本建議進(jìn)行rRNA去除再建庫(kù)，提高有效數(shù)據(jù)占比；二是對(duì)核酸含量低的樣本，直接進(jìn)行RNA建庫(kù)，減少核酸損失，提升建庫(kù)成功率，并加大測(cè)序深度。

其次，在測(cè)序環(huán)節(jié)采用華大智造MGISEQ-200測(cè)序儀，它不僅小巧靈活，同時(shí)高效專(zhuān)注，已協(xié)助全國(guó)多地疾控中心完成鑒定并成功拼接出各地首例新冠病毒序列。

最后，通過(guò)病原鑒定系統(tǒng)對(duì)新冠病毒序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并采用IDBA方法完成拼接。

這樣，即使是在未去除宿主的情況下，也可以滿足宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序病毒序列組裝對(duì)數(shù)據(jù)量的要求，保證序列信息的完整性。

圖2 針對(duì)新型冠狀病毒序列組裝的產(chǎn)品組合與策略

實(shí)例解析新冠病毒全基因組序列獲取全流程

接下來(lái)，我們將以某疾控中心收到的1例新冠病毒肺炎疑似樣本為例，為您解析該CDC首例新型冠狀病毒感染病例呼吸道標(biāo)本宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及病毒序列組裝全流程：

新冠病毒全基因組序列獲取全流程

2020年1月20日 - 1月22日上午

1月20日，文庫(kù)制備

針對(duì)核酸量不同的樣本，團(tuán)隊(duì)分別采用了不同的建庫(kù)策略，并使用MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑套裝進(jìn)行建庫(kù)。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、接頭連接、PCR擴(kuò)增、純化等一系列操作后獲得文庫(kù)產(chǎn)物，再使用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，制備DNA納米球。

圖4 MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑套裝

1月21日，上機(jī)測(cè)序

基于MGISEQ-200平臺(tái)，對(duì)該地發(fā)現(xiàn)的首例病例的呼吸道標(biāo)本進(jìn)行300M的高深度測(cè)序。

1月22日上午，數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)出32Gb數(shù)據(jù)，總reads數(shù)318M。結(jié)合病原感染快速鑒定系統(tǒng)，鑒定出2,337,442條新型冠狀病毒reads。

1月22日上午，拼接組裝

分析軟件自動(dòng)將2,337,442條的新型冠狀病毒reads從所有序列中抽出。使用拼接效率高的IDBA方法進(jìn)行組裝，成功完成新型冠狀病毒的序列組裝，獲得基因組序列全長(zhǎng)29.9kb。

知己知彼，百戰(zhàn)不殆。盡管我們對(duì)新型冠狀病毒的認(rèn)識(shí)有待進(jìn)一步研究，但通過(guò)宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和病毒序列組裝獲得新型冠狀病毒全基因組序列，有助于揭示病毒相關(guān)特性。通過(guò)對(duì)全基因組序列相似性比較和變異位點(diǎn)分析，可以為構(gòu)建進(jìn)化圖譜、追溯病毒來(lái)源、追蹤變異路徑、了解致病機(jī)理等提供重要參考信息，助力抗擊疫情。