近日，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院聯(lián)合中科院生物物理研究所和深圳三院國(guó)家傳染病臨床研究中心在Nature Communications雜志發(fā)表慢乙肝干擾素功能性治愈研究的最新成果，題為“Interferon stimulated immune profile changes in a humanized mouse model of HBV infection”。該研究中的單細(xì)胞測(cè)序基于華大智造DNBelab C4單細(xì)胞文庫(kù)制備試劑盒和DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)。

該研究成功構(gòu)建了一種能真實(shí)應(yīng)答人干擾素的huIFNAR小鼠模型，分析得到人干擾素的組織特異性應(yīng)答譜，在該小鼠模型中證明干擾素能夠降低血清HBsAg水平，并發(fā)現(xiàn)特定細(xì)胞類(lèi)型可能在實(shí)現(xiàn)HBV治愈中起到重要作用。

干擾素是目前實(shí)現(xiàn)乙肝功能性治愈公認(rèn)的臨床藥物。在核苷經(jīng)治及兒童慢乙肝等特殊人群中，干擾素治療可獲得高比例HBsAg轉(zhuǎn)陰，但干擾素實(shí)現(xiàn)乙肝功能性治愈機(jī)制未明，這主要受限于缺少相關(guān)的動(dòng)物模型。干擾素具有明顯種屬特異性，一方面，人和小鼠干擾素氨基酸序列相去甚遠(yuǎn)，以I型干擾素為例，在序列上，小鼠中沒(méi)有與人完全一致的干擾素。同時(shí)，臨床上人IFNα2在小鼠中沒(méi)有相同對(duì)應(yīng)物。另一方面，小鼠干擾素受體與人干擾素受體在序列上相似性只有一半左右（圖1）。因此，建立人干擾素功能研究的替代性模型極為迫切。

圖1：I型干擾素序列比對(duì)以及人和小鼠I型干擾素受體胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)

該研究首先通過(guò)基于CRISPR/cas9的敲入策略構(gòu)建了I型干擾素受體人源化小鼠(huIFNAR小鼠)。并體外通過(guò)huIFNAR小鼠和人PBMCs對(duì)人IFN刺激的基因表達(dá)譜對(duì)比實(shí)驗(yàn)（圖2），證明該小鼠模型可模擬人對(duì)人源IFN刺激的免疫應(yīng)答特征，支持了該huIFNAR小鼠可作為人干擾素研究的替代模型。

圖2：huIFNAR敲入策略示意圖以及huIFNAR小鼠與人PBMCs對(duì)人IFN刺激反應(yīng)的相似性分析

隨后，該團(tuán)隊(duì)研究了腦、血、肺、心、肝、脾、腎、肌肉、腸9個(gè)主要組織對(duì)人干擾素刺激的體內(nèi)應(yīng)答圖譜。首次揭示了健康個(gè)體對(duì)人干擾素應(yīng)答的組織和器官特異性，其中，血液和肝臟免疫應(yīng)答最明顯，而腸道和腦免疫應(yīng)答最弱（圖3）。該研究所描繪的器官和組織特異性干擾素應(yīng)答圖譜尚未在健康人體中報(bào)道。

圖3：人PEG-IFNα2作用后的9大組織特異性應(yīng)答圖譜

通過(guò)使用DNBelab C4單細(xì)胞文庫(kù)制備試劑盒和DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000測(cè)序儀對(duì)肝臟CD8T細(xì)胞群進(jìn)行更為詳盡亞群分析，發(fā)現(xiàn)Teff CD8T細(xì)胞群的比例顯著增加。Teff CD8T主要富集細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、趨化性和趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)、白細(xì)胞介素12產(chǎn)生、T細(xì)胞受體和Toll樣受體信號(hào)簇相關(guān)分子細(xì)胞通路。推斷huIFNAR-IFNα2可促使Teff CD8T細(xì)胞表現(xiàn)出在激活、細(xì)胞毒性和趨化作用方面功能的提升。但未預(yù)料到的是，Teff CD8T細(xì)胞也表達(dá)耗竭相關(guān)特異性基因（Lag3、Havcr2、Pdcd1和CTLA4）以及呈現(xiàn)耗竭基因表達(dá)譜特征。Teff CD8T中耗竭生物標(biāo)志物的共表達(dá)可能會(huì)降低其在體內(nèi)抑制乙型肝炎病毒的作用效力（圖4）。

圖4：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序揭示慢性干擾素刺激介導(dǎo)的CD8T細(xì)胞亞群變化特征

最后，該研究構(gòu)建AAV-HBV慢性HBV感染模型，評(píng)價(jià)人干擾素的抗HBV作用。人長(zhǎng)效干擾素治療15周可顯著降低HBsAg和HBeAg，甚至實(shí)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化，成功模擬了干擾素在臨床上的長(zhǎng)期治療效果。通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行了探索。研究發(fā)現(xiàn)干擾素激活肝內(nèi)單核細(xì)胞和效應(yīng)記憶CD8T細(xì)胞從而起到降低HBsAg的作用（圖5）。同時(shí)該研究也發(fā)現(xiàn)該群CD8T細(xì)胞中高表達(dá)PD-1等抑制性分子，這也支持干擾素聯(lián)合PD-1抑制劑可能是實(shí)現(xiàn)乙肝功能性治愈的潛在治療方案。

圖5：人PEG-IFNα2抗HBV作用研究

該研究建立的huIFNAR小鼠能夠真實(shí)地響應(yīng)人干擾素刺激，同時(shí)在該模型中發(fā)現(xiàn)PEG-IFNα2治療成功抑制肝內(nèi)HBV復(fù)制，實(shí)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化，該小鼠模型為研究干擾素體內(nèi)的功能和評(píng)估干擾素實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈機(jī)制提供了平臺(tái)（圖6）。

圖6：文章圖形摘要

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院王亞萍，郭栗良子，石靜蓉，中科院生物物理研究所李靖云博士，深圳三院國(guó)家傳染病臨床研究中心文艷玲博士和廣州欣意生物古國(guó)銘為本論文共同第一作者。廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市八醫(yī)院李鋒研究員和唐小平教授為共同通訊作者。

*本文部分轉(zhuǎn)載自病毒學(xué)界