近日，來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭浩課題團隊聯(lián)合清華大學(xué)邢新會教授、張翀教授團隊、華大智造研發(fā)團隊，在微生物學(xué)領(lǐng)域知名期刊Microbiome（IF= 19.4）上發(fā)表了題為“Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis”的論文1，該研究利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)，構(gòu)建了地熊蜂(Bombus terrestris)腸道細(xì)菌Snodgrassella的突變體文庫。

通過在無菌蜜蜂模型體內(nèi)的連續(xù)傳代，追蹤了Snodgrassella菌株的適應(yīng)性定殖過程，觀察到定殖能力增強的菌株在mglB基因中表現(xiàn)出顯著的遺傳變化，暗示其通過改變腸道菌IV型菌毛依賴性運動系統(tǒng)促進腸道菌的體內(nèi)定殖。該研究中，針對單點突變位點的擴增子測序工作基于華大智造DNBSEQ-E25平臺完成，以用于快速高通量檢測腸道細(xì)菌的群落組成。

背景介紹

宿主腸道環(huán)境通常會對微生物帶來較強的選擇性壓力，促使細(xì)菌保持特定性狀以成功定殖，從而在長期共生過程中形成宿主特異性。識別宿主選擇的特征對于理解動物和共生微生物之間不斷發(fā)展的相互作用過程至關(guān)重要。

然而，當(dāng)前的實驗方法主要集中在模式細(xì)菌上，如高突變大腸桿菌或通過宿主傳播而發(fā)生遺傳變化的野生菌株，無法全面揭示腸道微生物定殖和宿主特異性形成的過程，此研究利用ARTP誘變技術(shù)突破自發(fā)突變率低的限制，以便在溫和條件下研究腸道細(xì)菌的分子進化機制。

研究成果

01

ARTP誘導(dǎo)的特定突變可能導(dǎo)致Snodgrassella在非本地宿主中定殖

本研究利用ARTP技術(shù)構(gòu)建了Snodgrassella communis B10998菌株的輸入突變體文庫，通過優(yōu)化暴露時間實現(xiàn)了高突變率（圖1A，B）。為了探索促成定殖的遺傳機制，在非本地宿主意大利蜜蜂（A. mellifera）中評估了突變體的定殖潛力，盡管突變體整體定殖水平低于野生型，但高劑量接種（圖1C，D, E）和連續(xù)傳代可提高其在宿主中的定殖能力（圖1 F，G），暗示著突變可能有助于S. communis菌株提升在非本地宿主中的競爭優(yōu)勢。

圖1. ARTP處理獲得的Snodgrassella communis突變體在非本地宿主中的定殖

02

Snodgrassella菌株腸道定殖的潛在突變

通過研究在無菌蜜蜂模型體內(nèi)連續(xù)傳代下不同菌株基因的突變數(shù)量和頻率（圖2A），發(fā)現(xiàn)突變數(shù)量和平均突變頻率并無顯著變化。為了進一步評估不同蜂群中的突變模式，使用SnpEff工具對變異類型和功能進行了注釋，發(fā)現(xiàn)SNPs是最普遍的突變類型，而插入突變只在D10組中發(fā)現(xiàn)（圖2C），大多數(shù)突變?yōu)殄e義突變，可能會影響基因表達或蛋白質(zhì)活性（圖2D）。這些結(jié)果表明，Snodgrassella菌株腸道定殖的遺傳變異在連續(xù)傳代過程中保持穩(wěn)定，突變的頻率和模式?jīng)]有顯著變化。

圖2. 體內(nèi)傳代過程中細(xì)菌的突變特征

03

mglB突變使細(xì)菌在非本地宿主中具有競爭優(yōu)勢

通過分析實驗過程中出現(xiàn)的基因突變位置和頻率，發(fā)現(xiàn)大部分的突變頻率在5%到20%之間，并且沒有特定的基因組位置偏向。特別地，rpsG和glcA突變在傳代過程中以100%的頻率保留下來（圖3A）。此外，mglB點突變的頻率在譜系2（P1L2）的第1代中僅為6.9%，但在第2代中迅速上升至100%，并在第3代中保持不變（圖3B），這表明mglB突變可能為微生物腸道定殖帶來競爭優(yōu)勢，通過PCR（圖3C）和測序?qū)嶒烌炞C了這些突變的存在和頻率，結(jié)果與預(yù)測結(jié)果高度一致。

圖3 mglB中發(fā)生的點突變可能帶來競爭優(yōu)勢

04

Snodgrassella菌株中的mgl操縱子

MglB是mgl操縱子的關(guān)鍵組成部分，對調(diào)節(jié)細(xì)菌的運動性至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，從蜜蜂和大黃蜂中分離的S. communis菌株都發(fā)現(xiàn)了mgl操縱子，所有蜜蜂腸道S. communis菌株均含有三個mglB基因(圖4A，B)。同時進一步確定了第3組中mgl操縱子的排列（圖4C），表明mglB基因可能經(jīng)歷了重復(fù)或水平轉(zhuǎn)移。

圖4. Snodgrassella中的mgl操縱子

05

mglB的突變增強了適應(yīng)性優(yōu)勢

研究人員探討了S. communis菌株中mglB基因的錯義突變對表型的影響，先前的研究表明，mglB基因在調(diào)節(jié)IV型菌毛依賴性細(xì)胞運動中起著重要作用，ΔmglB細(xì)胞會表現(xiàn)出改變的菌落形態(tài)和滑行運動能力。在菌落擴增試驗中，SA01065突變體在0.5%瓊脂上表現(xiàn)出與其他菌株完全不同的形態(tài)，形成了密集的樹枝狀結(jié)構(gòu)，遍布培養(yǎng)基表面（圖5E-F），這表明其細(xì)胞運動能力發(fā)生了改變，進一步強調(diào)了mglB中發(fā)現(xiàn)的突變會影響細(xì)胞運動能力。

研究團隊還通過競爭實驗探究了mglB基因突變對細(xì)菌在西方蜜蜂（A. mellifera）和地熊蜂（B. terrestris）宿主中的腸道定殖能力的影響。結(jié)果顯示，即使在數(shù)量上處于劣勢，SA01065突變體在蜜蜂宿主中仍能成功定殖（圖5G，H），并且可以克服巨大的數(shù)量劣勢并顯著勝過背景突變體(SA01065')和野生型（WT）。

然而，在地熊蜂（B. terrestris）宿主中，即使SA01065突變體在接種物中的比例更高，SA01065'和野生型（WT）仍占據(jù)主導(dǎo)地位。此外還利用DNBSEQ-E25對擴增子進行測序確認(rèn)了群落組成，結(jié)果與桑格測序一致，證實了SA01065突變體在非本地蜜蜂宿主西方蜜蜂（A. mellifera）中定殖的競爭優(yōu)勢，而在本地蜜蜂宿主地熊蜂（B. terrestris）中定殖的競爭優(yōu)勢并不明顯。

圖5. mglB突變會影響細(xì)胞運動能力和體內(nèi)競爭優(yōu)勢

總結(jié)

本研究通過ARTP誘變技術(shù)獲得腸道共生細(xì)菌突變體文庫，并探究了這些變異基因在促進腸道細(xì)菌在蜜蜂宿主中定殖的分子機制，為未來研究腸道微生物和宿主的互作機制提供了新思路。其間，利用華大智造DNBSEQ-E25完成了部分腸道細(xì)菌群落檢測實驗，數(shù)據(jù)量充足，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高且與sanger測序結(jié)果一致。

DNBSEQ-E25是一款小巧輕便的基因測序儀，儀器占桌面積僅0.1 m2，運行速度快，對實驗室環(huán)境要求低，安裝、維護簡便，大大降低了測序的門檻，適合開展病原微生物檢測、宏基因組測序等應(yīng)用。用戶可根據(jù)研究對象選取擴增區(qū)域，設(shè)計引物進行擴增，再利用華大智造MGIEasy DNA文庫制備試劑盒完成從擴增產(chǎn)物到測序文庫制備的全流程，接頭連接、文庫擴增及一步法DNB制備的過程僅需3小時。

多重PCR擴增技術(shù)與高通量測序技術(shù)的融合，能夠?qū)颖局械奈⑸锶郝溥M行全面而深入的分析，為研究者提供強大的工具，以全面探索和理解微生物在健康、疾病以及生態(tài)系統(tǒng)中的作用。

參考文獻：Meng Y, Zhang X, Zhai Y, et al. Identification of the mutual gliding locus as a factor for gut colonization in non-native bee hosts using the ARTP mutagenesis[J]. Microbiome, 2024, 12(1): 93.