盡管基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（sequencing-based spatial transcriptomics，簡稱sST）顯著促進(jìn)了生物學(xué)領(lǐng)域在空間基因表達(dá)測量方面的進(jìn)步，但由于技術(shù)和數(shù)據(jù)集之間的差異性，該領(lǐng)域目前仍缺乏全面的基準(zhǔn)測試研究。2024年7月4日，廣州實驗室田魯亦團(tuán)隊和西湖大學(xué)劉曉東團(tuán)隊聯(lián)合墨爾本大學(xué)、哈佛大學(xué)等研究團(tuán)隊在Nature Methods發(fā)表了一篇題為“Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods”的研究成果。

該研究通過系統(tǒng)地比較11種sST方法，并利用小鼠胚胎、眼睛和大腦海馬區(qū)等參考組織生成了跨平臺數(shù)據(jù)集（cadasSTre），來評估這些技術(shù)在空間分辨率、捕獲效率和分子擴(kuò)散方面的性能。研究揭示了不同sST技術(shù)在下游應(yīng)用中展現(xiàn)的不同能力，并強(qiáng)調(diào)了sST數(shù)據(jù)中基因檢測偏差的存在。本研究旨在為研究人員在sST平臺選擇方面提供指導(dǎo)，促進(jìn)評估標(biāo)準(zhǔn)的共識，并為空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析計算工具的開發(fā)和基準(zhǔn)測試工作建立框架。

文章題目：Systematic comparison of sequencing-based spatial transcriptomic methods

發(fā)表時間：2024-07-04

發(fā)表期刊：Nature Methods

主要研究團(tuán)隊：廣州實驗室、西湖大學(xué)、墨爾本大學(xué)、哈佛大學(xué)等

影響因子：36.100

DOI：10.1038/s41592-024-02325-3

主要研究結(jié)果

01

基準(zhǔn)測試參考組織和實驗設(shè)計

對 11 種 sST 方法進(jìn)行了全面比較（包括 10X Genomics Visium（基于 poly-A 和基于探針的兩種方法）、DynaSpatial、HDST、BMKMANU S1000、Slide-seq V2、Curio Seeker（Slide-seq 的商業(yè)版本）、Slide-tag、Stereo-seq、PIXEL-seq、Salus 和 DBiT-seq）。發(fā)現(xiàn)每種技術(shù)都有其獨特的策略，并在不同的組織樣本中展現(xiàn)出不同的性能。

Stereo-seq（時空組學(xué)技術(shù)）的點中心距離小于10 μm，顯示了其卓越的空間分辨率。不僅如此，Stereo-seq能夠捕獲幾乎整個組織區(qū)域，如成年小鼠的大腦和E12.5小鼠胚胎，表明其廣泛的捕獲能力。此外，Stereo-seq在小鼠胚胎組織上展現(xiàn)出了出色的擴(kuò)散控制性能，為研究者提供了準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

相比之下，Slide-seq V2受限于捕獲面積較小，只能捕獲組織的一部分；而DBiT-seq的捕獲面積受微流控通道寬度限制，且存在跨通道污染的風(fēng)險。盡管HDST和BMKMANU S1000也表現(xiàn)出較好的捕獲能力，但Stereo-seq表現(xiàn)出了最高的捕獲能力，其常規(guī)陣列大小為1cm，最大尺寸可達(dá)13.2cm，成為研究細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組空間分布和相互作用的理想工具。

實驗設(shè)計概述與數(shù)據(jù)處理流程

02

分子捕獲效率

在評估不同sST方法的分子捕獲效率時，研究發(fā)現(xiàn)Stereo-seq在測序深度上顯著超越其他平臺，特別是在小鼠海馬體和眼部的分析中，Stereo-seq在同一區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生了更多的測序讀數(shù)，從而在總計數(shù)上表現(xiàn)優(yōu)異。然而，在控制測序深度后，Slide-seq V2在小鼠眼部和基于探針的Visium、DynaSpatial在海馬體中展現(xiàn)出更高的靈敏度。

Stereo-seq的優(yōu)勢在于其能夠生成大量的測序數(shù)據(jù)，這對于需要高靈敏度和深度解析的研究尤為重要。盡管Visium(probe)在某些情況下（如小鼠眼部）也表現(xiàn)出高靈敏度，但Stereo-seq在測序深度和潛在的信息捕獲能力上更為突出。此外，Stereo-seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示，每個點的計數(shù)和特征數(shù)量之間的關(guān)系在下采樣后更為顯著，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了其在處理復(fù)雜樣本時的潛力。

不同平臺生成數(shù)據(jù)的敏感性比較

03

分子側(cè)向擴(kuò)散

在評估不同空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在mRNA空間準(zhǔn)確性方面的性能時，通過對比Stereo-seq、Slide-seq V1.5/V2、PIXEL-seq和BMKMANU S1000等技術(shù)在不同組織（嗅球、大腦、眼組織）中利用標(biāo)記基因（Slc17a7、Ptgds和Pmel）的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Stereo-seq在眼組織中對側(cè)向擴(kuò)散的控制尤為出色。

雖然Stereo-seq在嗅球和大腦組織的側(cè)向擴(kuò)散控制方面存在不足，但在眼組織中其控制能力明顯優(yōu)于其他技術(shù)。這表明Stereo-seq在某些特定組織類型中可能具有獨特的優(yōu)勢，能夠為研究者提供更準(zhǔn)確的mRNA空間分布信息。

然而，值得注意的是，下采樣并不能解決Stereo-seq數(shù)據(jù)中的側(cè)向擴(kuò)散問題，這可能與該技術(shù)原理或?qū)嶒灢僮飨嚓P(guān)。因此，在選擇適合特定研究的空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)時，研究人員需要綜合考慮組織類型、實驗需求和技術(shù)特點。

不同平臺生成數(shù)據(jù)的擴(kuò)散比較

04

聚類和細(xì)胞注釋

在研究E12.5小鼠眼睛內(nèi)部細(xì)胞狀態(tài)復(fù)雜性的過程中，Stereo-seq在細(xì)胞亞群識別方面也表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。為了識別出更詳細(xì)且一致的細(xì)胞亞群，分別利用Seurat、DR.SC和PRECAST等軟件的聚類方法，對各sST平臺捕獲的數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)Stereo-seq和Slide-seq V2在全面亞群注釋方面表現(xiàn)突出，能夠成功捕獲所有預(yù)期的細(xì)胞亞群。

Stereo-seq不僅提供了良好的細(xì)胞亞群分離，還以其高捕獲靈敏度和對側(cè)向擴(kuò)散的有效控制，在識別復(fù)雜細(xì)胞亞群時表現(xiàn)尤為出色。相比之下，BMKMANU S1000在檢測細(xì)胞狀態(tài)，特別是識別黑色素細(xì)胞時面臨挑戰(zhàn)，可能與數(shù)據(jù)中的側(cè)向擴(kuò)散問題有關(guān)。而Visium技術(shù)則因其較低的物理分辨率和有限的捕獲位點數(shù)量，在檢測預(yù)期細(xì)胞亞群時受到限制。

聚類和注釋性能比較

05

不同技術(shù)之間的標(biāo)記基因檢測 

在評估不同空間轉(zhuǎn)錄組測序（sST）技術(shù)的性能時，Stereo-seq技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)勢在識別特定細(xì)胞類型標(biāo)記基因方面表現(xiàn)突出。通過Wilcoxon秩和檢驗在Seurat中進(jìn)行標(biāo)記基因識別，Stereo-seq在識別如Pax6、Hes和Sox2等關(guān)鍵基因時，展現(xiàn)了技術(shù)特異性偏差下的獨特準(zhǔn)確性。特別是在識別pNR3集群中的Pax6表達(dá)時，Stereo-seq顯示出了其他技術(shù)（如Slide-seq V2和BMKMANU S1000）無法比擬的準(zhǔn)確性，這體現(xiàn)了Stereo-seq在特定細(xì)胞類型標(biāo)記基因識別方面的獨特優(yōu)勢。

進(jìn)一步的下采樣數(shù)據(jù)分析表明，測序讀取量較少的細(xì)胞亞群，仍可被Stereo-seq技術(shù)輕松識別，并且Stereo-seq技術(shù)在處理具有相似表達(dá)譜的細(xì)胞亞群時，依然能保持較高的區(qū)分度，這進(jìn)一步強(qiáng)化了其在細(xì)胞亞群識別方面的優(yōu)勢。

盡管不同sST技術(shù)在基因檢測方面各有特點，可以相互補(bǔ)充，但Stereo-seq在特定細(xì)胞類型標(biāo)記基因識別方面的準(zhǔn)確性無疑為其贏得了顯著的優(yōu)勢。此外，盡管在細(xì)胞間通信分析方面，不同sST方法和通信方法（如CellChat和CellPhoneDB v4）未獲得一致結(jié)果，但這為未來的技術(shù)優(yōu)化和發(fā)展提供了方向。

研究總結(jié)

在這項研究中，研究者創(chuàng)建了一個名為cadasSTre的跨平臺數(shù)據(jù)集，旨在對基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）方法進(jìn)行基準(zhǔn)測試。通過對11種sST方法在實驗中的系統(tǒng)評估，深入比較了這些方法的靈敏度、擴(kuò)散性、聚類能力和標(biāo)記基因檢測等關(guān)鍵性能指標(biāo)。

研究結(jié)果顯示，Stereo-seq展現(xiàn)了卓越的捕獲效率，這一優(yōu)勢使得其在數(shù)據(jù)質(zhì)量和信息獲取方面脫穎而出。與此同時，盡管所有sST方法都面臨測序成本高昂和難以達(dá)到數(shù)據(jù)飽和水平的挑戰(zhàn)，Stereo-seq在提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)方面的效率尤為顯著。

此外，研究者還在Visium平臺上觀察到了意外的基因捕獲偏差，而Stereo-seq在多個組織類型中則展現(xiàn)了更穩(wěn)定和一致的捕獲效果。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)了Stereo-seq在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

在評估空間分辨率時，研究者認(rèn)識到捕獲位點大小雖然是一個重要指標(biāo)，但擴(kuò)散性對實際分辨率的影響更為關(guān)鍵。Stereo-seq在小鼠胚胎組織上展現(xiàn)了出色的擴(kuò)散控制，表明其在某些組織類型中具有較高的分辨率。然而，研究者也注意到Stereo-seq在小鼠大腦組織中存在較強(qiáng)的擴(kuò)散，提示不同組織類型可能需要特定的優(yōu)化條件以充分發(fā)揮Stereo-seq的性能。

sST方法的結(jié)果與特性概述

sST方法根據(jù)其在特定類別中的性能進(jìn)行了排名，最佳方法位于頂部。排名通過顏色和斑點大小在左側(cè)面板中直觀展示，而右側(cè)面板則概述了這些方法的關(guān)鍵特性，包括“設(shè)置復(fù)雜度”，即構(gòu)建每種方法的難易程度。

本研究是全球首個并且規(guī)模最大的空間組學(xué)技術(shù)的系統(tǒng)比較，并且建立了完整的評估方案，包括標(biāo)準(zhǔn)品的建立，實驗流程，數(shù)據(jù)分析流程，具體指標(biāo)等等，并且全部公開可重復(fù)。通過評估，一些國產(chǎn)的技術(shù)平臺的指標(biāo)已經(jīng)達(dá)到領(lǐng)先，凸顯了中國在這一新興領(lǐng)域的快速發(fā)展趨勢。該比較研究將在網(wǎng)站上https://genographix.com/home持續(xù)更新。