卵黃蛋白（vitellin，Vn）是一種高密度糖脂蛋白，是所有雌性卵生動(dòng)物卵黃的主要成分，在卵黃發(fā)生期迅速積累，儲(chǔ)存在卵中，是胚胎和幼體早期發(fā)育主要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。卵黃蛋白原（Vtg）是卵黃蛋白的前體，在生長(zhǎng)發(fā)育期間，卵泡內(nèi)發(fā)生的不同分子事件會(huì)影響Vtg的攝取。

為探究細(xì)胞連接是否與Vtg攝取的調(diào)節(jié)有關(guān)，奧塔哥大學(xué)動(dòng)物學(xué)系通過(guò)RNAseq比較了野生鰻魚(yú)卵黃發(fā)生前期（PV）和卵黃發(fā)生早期（EV）卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組，以研究編碼可能參與調(diào)節(jié)Vtg攝取的細(xì)胞連接蛋白的特異性基因的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)表于Cells，文章題為“Are Cell Junctions Implicated in the Regulation of Vitellogenin Uptake? Insights from an RNAseq-Based Study in Eel, Anguilla australis”。

研究設(shè)

計(jì)研究設(shè)計(jì)

研究團(tuán)隊(duì)從埃爾斯米爾湖捕獲野生短鰭鰻，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，鑒定出PV和EV鰻魚(yú)，解剖后稱重卵巢和肝臟，分別計(jì)算性腺指數(shù)（GSI）和肝體指數(shù)（HSI）。并對(duì)卵巢碎片進(jìn)行組織學(xué)分析，確認(rèn)性腺階段。

從卵巢碎片中提取總RNA，構(gòu)建鏈特異性cDNA文庫(kù)（MGIEasy RNA Directional library Prep Set V2.1，華大智造），進(jìn)行高通量測(cè)序。具體地，首先通過(guò)oligo-dT 選擇（oligo(dT) 磁珠富集Poly(A) mRNA）富集樣本中的mRNA，然后進(jìn)行片段化和逆轉(zhuǎn)錄；在接頭連接和PCR擴(kuò)增后，將cDNAs壓縮成DNA納米球，以便在DNBSEQ平臺(tái)上對(duì)100bp的成對(duì)reads進(jìn)行測(cè)序。

隨后，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)分析，在注釋的轉(zhuǎn)錄組上搜索編碼構(gòu)成細(xì)胞連接的蛋白質(zhì)的目標(biāo)基因，檢查目標(biāo)基因的差異表達(dá)并推導(dǎo)對(duì)應(yīng)于Vtg受體候選的蛋白質(zhì)序列。

1. 卵巢發(fā)育階段的特征

從PV到EV階段，GSI、HSI和OD顯著增加。由于脂滴和卵黃蛋白（Vtg摻入）的大量積累，EV卵母細(xì)胞尺寸明顯增大，而PV卵母細(xì)胞僅顯示少量脂滴，且在其細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有 Vtg 積累的跡象。

2.De Novo轉(zhuǎn)錄組及其下游分析

在DNBSEQ平臺(tái)上對(duì)每個(gè)樣本平均1425萬(wàn)個(gè)100bp的成對(duì)末端reads進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，從頭組裝產(chǎn)生了171,620個(gè)推測(cè)基因的282,469個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中25.6%被功能注釋。過(guò)濾掉低表達(dá)基因后，保留了32,447個(gè)基因，其中20,810個(gè)基因得到了功能注釋，占比64.1%。初始聚類分析顯示：樣本聚集成兩個(gè)不同的表型組，PV和EV。

GO富集分析還反映了PV和EV階段之間轉(zhuǎn)錄的差異。在PV-EV轉(zhuǎn)化過(guò)程中，3個(gè)生物學(xué)過(guò)程（內(nèi)吞作用、膜組織、陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié))和1個(gè)分子功能(鉀通道抑制劑活性）被上調(diào)。在每個(gè)GO類別中有超過(guò)15項(xiàng)被下調(diào)，主要與RNA代謝和卵殼形成有關(guān)，其中下調(diào)最多的GO項(xiàng)中，膜的整體成分及相同的蛋白結(jié)合包含編碼緊密連接（TJ）組成蛋白的基因（圖1）。最終，4878個(gè)基因差異表達(dá);從PV發(fā)展到EV階段時(shí)，2851個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2027個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

PV-EV之間的轉(zhuǎn)錄差異

3. PV-EV轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞連接的基因表達(dá)

RNAseq數(shù)據(jù)被進(jìn)一步用于研究哪些基因可能參與促進(jìn)該物種主動(dòng)積累Vtg的能力。結(jié)果顯示，在已鑒定的25個(gè)編碼不同類型TJ組成蛋白的基因中，有7個(gè)是差異表達(dá)的；在PV-EV轉(zhuǎn)變過(guò)程中，有2個(gè)基因上調(diào)，5個(gè)基因下調(diào)，這支持Vtg進(jìn)入卵磷脂受到顆粒細(xì)胞層內(nèi)緊密連接（TJ）網(wǎng)絡(luò)的限制。與此相反，只有5個(gè)GJs在卵巢中表達(dá)，且階段之間的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，因此間隙連接（GJ）參與調(diào)節(jié)Vtg攝取的化學(xué)屏障假設(shè)不受支持。

4.PV-EV轉(zhuǎn)化過(guò)程中受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制和Vtg加工相關(guān)基因的表達(dá)

利用RNAseq數(shù)據(jù)檢測(cè)與Vtg識(shí)別相關(guān)的基因的表達(dá)，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制，以及Vtg蛋白分解。在澳洲鰻從頭轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)編碼假定Vtg受體的基因（lr8，lrp13），這兩個(gè)基因在PV-EV轉(zhuǎn)變過(guò)程中均無(wú)差異表達(dá)；而編碼網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸?shù)幕蛟赑V-EV轉(zhuǎn)化過(guò)程中明顯上調(diào)，這表明它們也可能是蛋白質(zhì)到達(dá)卵膜后調(diào)節(jié)Vtg積累的重要因素。因此，基因表達(dá)模式可能有助于確定與Vtg攝取調(diào)節(jié)相關(guān)的合適候選者，為澳洲鰻提供新的序列數(shù)據(jù)。

結(jié)語(yǔ)

參考文獻(xiàn)：

Babio L, Lokman PM, Damsteegt EL, Dutoit L. Are Cell Junctions Implicated in the Regulation of Vitellogenin Uptake? Insights from an RNAseq-Based Study in Eel, Anguilla australis. Cells. 2022 Feb 4;11(3):550. doi: 10.3390/cells11030550. PMID: 35159359; PMCID: PMC8834532.

（本文來(lái)源測(cè)序中國(guó)，作者：maisuier）