作為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)，CRISPR-Cas9在癌癥、遺傳病治療以及動(dòng)植物基因研究中都有著巨大的應(yīng)用潛力。雖然可對(duì)DNA進(jìn)行特定切割，具有靶向修飾效率高、多靶點(diǎn)編輯和編輯RNA的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但CRISPR/Cas存在明顯的缺點(diǎn)：如果靶基因附近沒有PAM（Protospacer Adjacent Motif）則無法實(shí)現(xiàn)編輯，同時(shí)還面臨脫靶效應(yīng)問題。

脫靶效應(yīng)是影響基因編輯技術(shù)能否廣泛應(yīng)用的主要限制因素，如何正確評(píng)估、檢測(cè)脫靶效應(yīng)，并提出相應(yīng)的策略降低脫靶效應(yīng)，是當(dāng)前基因編輯研究領(lǐng)域的重要研究方向之一。已有研究顯示，全基因組測(cè)序法是檢測(cè)脫靶效應(yīng)最簡(jiǎn)單有效的方法之一。2015年，韓國(guó)生命科學(xué)技術(shù)研究院科研團(tuán)隊(duì)曾在Nature Methods發(fā)表研究性文章“Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells”，強(qiáng)調(diào)了全基因組測(cè)序在鑒定CRISPR-Cas技術(shù)脫靶效應(yīng)中的關(guān)鍵作用，并首次提出Digenome-seq的概念。

圖1.文章發(fā)表在Nature Methods

近期，韓國(guó)同一科研團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology發(fā)表了基因編輯最新研究成果，利用DNBSEQ-T7平臺(tái)（華大智造）完成了基于Digenome-seq測(cè)序的CRISPR- Cas12f1脫靶效應(yīng)驗(yàn)證。研究人員通過對(duì)gRNA進(jìn)行個(gè)性化改造，構(gòu)建了一種高效、特異的基因組編輯工具——CRISPR-Cas12f1。DNBSEQ-T7全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)證實(shí)，該系統(tǒng)特異性高、脫靶位點(diǎn)明顯減少。當(dāng)利用AAV載體傳遞時(shí)，CRISPR-Cas12f1系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)多路復(fù)用和高效的基因組編輯。

CRISPR/Cas脫靶效應(yīng)的高低關(guān)鍵之一在于gRNA設(shè)計(jì)，如果gRNA和非目標(biāo)區(qū)域有過多的非特異性結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致脫靶效率較高。因此，gRNAs的設(shè)計(jì)和改造有助于提高CRISPR工具在簡(jiǎn)便性、多路復(fù)用、特異性等方面的能力。研究團(tuán)隊(duì)為了優(yōu)化Cas12f1的gRNA，利用已有g(shù)RNA改造的背景知識(shí)，在tracrRNA和crRNA序列中確定了5個(gè)潛在的修飾位點(diǎn)（MSs）進(jìn)行改造，最終獲得了一個(gè)強(qiáng)大的、非常緊湊的CRISPR-Cas12f1系統(tǒng)。數(shù)據(jù)顯示，工程改造gRNAs可使得大多數(shù)靶基因位點(diǎn)indel頻率顯著增加，其中一條gRNA誘導(dǎo)的平均效率甚至提高了867倍。

圖3. gRNA總體改造策略，來源: Nature Biotechnology

除了Cas12f1的緊湊性外，該系統(tǒng)對(duì)基因治療還有一個(gè)額外的優(yōu)勢(shì)：可以誘導(dǎo)dsDNA在原間隔序列外的分裂。這一特性意味著，即使在第一輪介導(dǎo)的indel突變之后，原始間隔層序列也可能保持不變，dsDNA裂解過程可以繼續(xù)進(jìn)行。

考慮到Cas12f1在細(xì)胞中的持續(xù)活性，因此檢測(cè)CRISPR-Cas12f1系統(tǒng)的特異性尤為重要。研究團(tuán)隊(duì)使用Cas-OFFinder（一種潛在脫靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)算法）鑒定了潛在脫靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)位點(diǎn)和基因間區(qū)域Cas12f1具有更高的靶內(nèi)效率。

研究人員探索了AAV與CRISPR-Cas12f1在治療方面的功效，對(duì)c.2991+1655A>G突變位點(diǎn)兩側(cè)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一對(duì)強(qiáng)效sgRNA。利用該sgRNA構(gòu)建了攜帶Cas12f1系統(tǒng)的AAV載體，并評(píng)估比較了Cas12f1在HEK293T細(xì)胞中誘導(dǎo)缺失的效率。發(fā)現(xiàn)Cas12f系統(tǒng)導(dǎo)致的缺失水平較高，Cas12f1基因缺失率較對(duì)照組高約46%。表明Cas12f1可能為基因治療提供一個(gè)多功能、有效的基因組編輯系統(tǒng)。

圖5. CRISPR-Cas12f1可與AAV進(jìn)行整合，來源: Nature Biotechnology

在這項(xiàng)最新研究中，華大智造DNBSEQ-T7出色完成了全基因組測(cè)序任務(wù)。研究人員根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)得出了關(guān)鍵結(jié)論之一：CRISPR-Cas12f1系統(tǒng)脫靶效應(yīng)更低，表明DNBSEQ-T7測(cè)序儀性能穩(wěn)定，可產(chǎn)出高質(zhì)量全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。

準(zhǔn)確無誤的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)是得出正確結(jié)論的關(guān)鍵，而高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)主要得益于建庫和穩(wěn)健高效的測(cè)序儀。華大智造于2018年推出的超高通量基因測(cè)序儀DNBSEQ-T7可支持全基因組測(cè)序，具有高達(dá)6Tb的日常數(shù)據(jù)輸出能力，可在一天內(nèi)完成多達(dá)60例人類全基因組測(cè)序。上述研究結(jié)果表明，DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)能夠提供高質(zhì)量全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，用于基因編輯結(jié)果檢測(cè)、特異性和脫靶效應(yīng)鑒別等。