2019年11月，由昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院主導(dǎo)，深圳華大生命科學(xué)研究院等單位合作完成的最新研究成果“Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture”在國際著名學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》（Science）上在線發(fā)表。

文章利用單細(xì)胞測序技術(shù)解析了靈長類胚胎著床后特別是原腸運(yùn)動時(shí)期重要的分子與細(xì)胞生物學(xué)事件，這對研究發(fā)育、衰老、人類疾病等領(lǐng)域有重大的推動作用。其中，華大智造DNBSEQ? 平臺技術(shù)為研究提供了高質(zhì)量的工具支撐。關(guān)于其原理優(yōu)勢，此前已有文章表明DNBSEQ? 在針對單細(xì)胞的SNP calling等方面具有明顯優(yōu)勢。

單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展日新月異，催生了諸多領(lǐng)域突破，華大智造近期發(fā)布的 “可以裝進(jìn)口袋的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室”——DNBelab C系列產(chǎn)品也為單細(xì)胞文庫制備提供了便攜式、即時(shí)化、一站式的工具支撐。搭配華大智造測序平臺及單細(xì)胞分析軟件，就可以完成單細(xì)胞組學(xué)研究全流程。

研究摘要

靈長類胚胎早期著床后發(fā)育是哺乳動物發(fā)育的里程碑事件，然而這一階段也是胚胎發(fā)育研究中最不清晰的時(shí)期之一。本研究成功實(shí)現(xiàn)了食蟹猴胚胎體外20天培養(yǎng)，并通過對受精后9到20天的體外培養(yǎng)胚胎進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)胚胎呈現(xiàn)出與體內(nèi)發(fā)育胚胎高度一致的形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)特征。

本文利用單細(xì)胞測序技術(shù)對體外培養(yǎng)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胚胎細(xì)胞進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)發(fā)育胚胎細(xì)胞高度類似的分化與基因表達(dá)軌跡。該研究第一次利用體外系統(tǒng)，解析了靈長類胚胎著床后特別是原腸運(yùn)動時(shí)期重要的分子與細(xì)胞生物學(xué)事件。研究結(jié)果有助于加深人們對早期著床后胚胎發(fā)育的理解，對于細(xì)胞替代性治療及器官再生研究也具有指導(dǎo)意義。

研究方法

靈長類動物受精卵發(fā)育第7-20天變化

（備注：EPI:外胚層PE: 原始內(nèi)胚層TE: 滋養(yǎng)層AMEC: 羊膜上皮細(xì)胞PGC: 原始生殖細(xì)胞 EXMC：胚外間充質(zhì)細(xì)胞GAS：原腸胚細(xì)胞）

部分結(jié)果展示

本研究對食蟹猴胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，使其能夠在體外培養(yǎng)20天，通過下圖1可以觀察到20天內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）細(xì)胞不斷增殖形成盤狀結(jié)構(gòu)。

圖1 食蟹猴胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)（A:第7-20天觀察的胚胎形狀；B:胚胎盤長度；C: 第15天和第17天體外培養(yǎng)胚胎的絨毛樣本結(jié)構(gòu)，箭頭表示絨毛狀結(jié)構(gòu)）

通過免疫組化的方法分析體外培養(yǎng)的胚胎在不同時(shí)期蛋白表達(dá)相關(guān)情況，培養(yǎng)胚胎呈現(xiàn)出了與體內(nèi)發(fā)育胚胎高度一致的形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)特征（圖2、圖3）。第14天開始，在羊膜中出現(xiàn)T+/SOX17+/TFAP2C+細(xì)胞（圖2），這些都與體內(nèi)發(fā)育胚胎表達(dá)情況一致（圖3），揭示了羊膜上皮是潛在的原始生殖細(xì)胞起源地。

圖2免疫熒光染色結(jié)果（體外培養(yǎng)胚胎第13、14、16、17天，箭頭表示羊膜內(nèi)的原始生殖樣細(xì)胞；短箭頭表示外胚層下方的原始生殖樣細(xì)胞）

圖3原始生殖細(xì)胞mark gene表達(dá)情況

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性分析

本文利用單細(xì)胞測序技術(shù)對體外培養(yǎng)7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胚胎細(xì)胞進(jìn)行測序（第9、11、13、15、17、19和20天），通過t-SNE降維分析, 下圖A鑒定出四組細(xì)胞（分布來自外胚層(EPI)、原始內(nèi)胚層(PE，VE/YE)、滋養(yǎng)外胚層(TE)和胚外間充質(zhì)(EXMC)，這些細(xì)胞與體內(nèi)鑒定的細(xì)胞類型相同。

下圖C、D是滋養(yǎng)外胚層(TE)分化軌跡：從第11天開始TE細(xì)胞逐步分化，隨著CDX2表達(dá)的減少，TE細(xì)胞被分為兩種類型，表達(dá)高水平TCEAL4的細(xì)胞可能是滋養(yǎng)層細(xì)胞（CTS），表達(dá)高水平GCM1的細(xì)胞可能是合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（STS）。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了小鼠中公認(rèn)的滋養(yǎng)層干細(xì)胞標(biāo)志物CDX2在靈長類早期胚胎發(fā)育中表達(dá)并不能維持。

下圖E是原始內(nèi)胚層(PE，VE/YE)細(xì)胞的發(fā)育軌跡，可分化為兩個(gè)細(xì)胞簇。細(xì)胞簇1和細(xì)胞簇2分別表達(dá)高水平的apoa2和cxcr4。

下圖F其中細(xì)胞簇1表達(dá)與脂代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，而細(xì)胞簇2主要表達(dá)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的基因。

下圖G是外胚層EPI細(xì)胞簇的分化軌跡，EPI-A和EPI-B與體內(nèi)早期EPI細(xì)胞簇在一起，EPI-C與體內(nèi)晚期EPI簇在一起，Gast與體內(nèi)原腸胚細(xì)胞簇在一起。

討論

靈長類動物早期胚胎發(fā)育與人高度相似，但對于靈長類動物著床后胚胎發(fā)育的研究依然難以開展，人力物力花費(fèi)巨大。

為了深入探索靈長類胚胎著床后發(fā)育過程中的分子機(jī)制，本研究實(shí)現(xiàn)了食蟹猴胚胎體外20天的培養(yǎng)，培養(yǎng)胚胎呈現(xiàn)出了與體內(nèi)發(fā)育胚胎高度一致的形態(tài)學(xué)與基因表達(dá)特征，但是體外培養(yǎng)胚胎的結(jié)構(gòu)最終在20天左右崩潰，需要進(jìn)一步改進(jìn)培養(yǎng)參數(shù)以實(shí)現(xiàn)更長時(shí)間的體外胚胎發(fā)育。

體外培養(yǎng)的食蟹猴胚胎細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞組學(xué)分析滋養(yǎng)外胚層、多能外胚層、原始內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄組譜，發(fā)現(xiàn)外胚層（epiblast）細(xì)胞在分化中的細(xì)胞亞型與狀態(tài)變化，并揭示了氧化磷酸化途徑在na?ve多能性維持中的作用；證實(shí)了體外分化的原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞與體內(nèi)原始生殖細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平的高度類似性。通過對細(xì)胞配體和受體基因表達(dá)的分析，揭示了外胚層、多能外胚層、原始內(nèi)胚層譜系細(xì)胞間的互相作用關(guān)系，例如FGF和WNT通路在譜系分化中的重要作用。

體外培養(yǎng)胚胎開辟了一個(gè)嶄新的研究平臺，有助于深入了解靈長類動物早期發(fā)育過程中的動態(tài)分子和細(xì)胞變化，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞追蹤技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)，將有助于確定細(xì)胞發(fā)育分化的規(guī)律和途徑。該研究工作首次利用體外系統(tǒng)，揭示了植入后早期非人類靈長類動物胚胎發(fā)生的關(guān)鍵發(fā)展事件和復(fù)雜的分子機(jī)制，有助于對人類早期著床后胚胎發(fā)育的理解。