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全球新冠疫情依然嚴峻。在當前的背景下，智造微課推出了#戰(zhàn)疫特別版#，有幸邀請到了近期預印在bioRxiv的文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》作者之一，為我們介紹在新冠檢測中高通量檢測常見的方法對比，并詳細介紹了多重PCR擴增子測序的原理及優(yōu)勢。

新冠病毒檢測方法對比

在新冠病毒檢測過程中，會面臨很多實際問題，例如樣本組成比較復雜，樣本的病毒載量較低，并且RNA病毒很容易降解等，這些都會影響檢測結果的準確性，為臨床診斷帶來很大困擾。當前，檢測方法眾多，各有不同，但如何在臨床檢測中根據(jù)不同樣本情況、條件和目的選擇適合的檢測方法，尚缺乏系統(tǒng)性的研究。

近期預印在bioRxiv的文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》對比了宏基因組測序（Meta）、探針捕獲測序（Capture）和多重PCR擴增子測序（Amplicon）三種方法在新冠檢測中的優(yōu)劣勢。可以為臨床及科研工作者在選擇不同檢測方法時，提供參考依據(jù)。

文章分析了三種方法在病毒全基因組上的覆蓋度均一性、富集效果、突變檢測準確性以及相同檢測所需要的數(shù)據(jù)量對比，并著重展示了多重 PCR在病毒檢測中的各項性能指標，最后文章給出了不同情況下的選擇參考指導，并指出：如果研究者只想研究目標微生物，并只關注最主要的堿基突變，且面對的樣本極具挑戰(zhàn)性（病毒載量<10²copies/ml，ct值>35），推薦多重PCR擴增子測序方法。

文章中使用的多重PCR方法采用了華大智造最新推出的ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0試劑盒產(chǎn)品。該產(chǎn)品針對三個不同類型的DNA靶標進行捕獲，能夠準確獲取樣本病毒載量信息。該產(chǎn)品針對三個不同類型的DNA靶標進行捕獲，能夠準確獲取樣本病毒載量信息。

1. 捕獲已知濃度的人工合成的DNA--外參；

2. 捕獲病毒全長基因組DNA；

3. 捕獲病毒宿主-人GAPDH基因--內(nèi)參。

新冠病毒多重PCR擴增子測序性能

華大智造ATOPlex平臺超高重PCR擴增技術，可在單管中實現(xiàn)病毒全長基因組的富集，最大程度降低樣本交叉污染風險，整個實驗操作只需簡單3步，快速便捷，結合DNBSEQ測序平臺可輕松獲得SARS-CoV-2病毒全基因組信息。

基于該技術開發(fā)的華大智造ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0試劑盒可用于新冠病毒的檢測、鑒定以及進化研究，能夠獲得病毒耐藥性、病毒細胞含量等生物學信息。該產(chǎn)品性能表現(xiàn)優(yōu)異，結果顯示比對率及特異性均大于95%，均一性也在90%以上，研究同時做了兩次平行實驗考察方法的穩(wěn)定性，結果顯示R²值為0.9798，表明兩次結果無明顯差異。在低病毒載量的情況下，基因組覆蓋率大于99%，并且病毒基因組5'端和3'端均無明顯下降。目前有兩種測序類型可供選擇，PE100可用于病毒鑒定和全基因組信息獲取，如僅需檢測病毒則可選擇SE50，最低數(shù)據(jù)量僅為1M reads。

在性能測試實驗中，研究人員將病毒培養(yǎng)提取物轉(zhuǎn)換成cDNA后，進行了6個梯度的濃度測試（10X稀釋），所有稀釋樣本摻入已知濃度人工合成DNA和人基因組DNA，然后同時進行多重PCR測序和RT-PCR。結果顯示，對于10^-6梯度稀釋的樣本，RT-PCR無法檢測出，但多重PCR仍可以檢出，同時與水的樣本結果顯著差異，這表明在極低濃度的情況下，使用多重PCR方法優(yōu)于RT-PCR，并且假陽性率低。

新冠病毒多重PCR擴增子測序挑戰(zhàn)

多重PCR方法有諸多優(yōu)勢，但也同樣面臨挑戰(zhàn)，例如樣本污染，因此在研發(fā)過程中，我們也進行了改善，相較于其他多重PCR方法，ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0試劑盒產(chǎn)品可實現(xiàn)全長基因組一管擴增，有效降低樣本交叉污染；為防止氣溶膠污染特別設計了污染物清除體系，有效降低氣溶膠對后續(xù)PCR的影響；同時采用雙唯一Barcode結合DNBSEQ測序方法避免Barcode串擾問題，降低了在大規(guī)模平行測序過程中強陽性樣本對弱陽性或陰性樣本的污染。基于上述技術，SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel試劑盒產(chǎn)品能夠最大程度上避免樣本污染，減少假陽性。

新冠病毒多重PCR擴增子測序產(chǎn)品組合 

目前，基于華大智造ATOPlex多重PCR定制產(chǎn)品平臺開發(fā)的ATOPlex SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel V1.0試劑盒產(chǎn)品可支持全流程自動化，從樣本抽提到數(shù)據(jù)分析，最快可24小時內(nèi)完成并出具檢測報告。其中建庫部分搭配華大智造自主研發(fā)的自動化建庫儀MGISP-100或MGISP-960，可支持8-192個樣本同時建庫，全自動化操作避免人為干擾，有效節(jié)省寶貴時間。核心測序采用DNBSEQ平臺，可提供高中低多種通量選擇，檢測結果更準確。