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本期在線技術研討會關注如何進行基于DNBSEQ?平臺的RNA測序。具體解釋了為什么我們要進行RNA測序，RNA的分類以及進行RNA測序的應用有哪些，RNA測序的全流程是什么？最后對華大智造的RNA類產(chǎn)品進行了相關的解釋，對RNA產(chǎn)品的選擇進行了指導等。

知識點1 ：為什么要做RNA測序？

本期課程中，首先從中心法則開始，講解RNA是從DNA轉(zhuǎn)錄而來，RNA測序也叫做轉(zhuǎn)錄組測序。通過對轉(zhuǎn)錄組進行研究，了解轉(zhuǎn)錄組的變化帶來的生命現(xiàn)象的變化，才能從中發(fā)現(xiàn)生命最本質(zhì)的變化。

回顧RNA進行研究的技術進展，從最開始的Northern 雜交，到RT-qPCR等等，直到2007年，基于高通量測序的DGE（Digital Gene Expression profiling數(shù)字基因表達譜）技術和2009年升級版的DGE RNAseq技術的出現(xiàn)，可以更高通量的檢測基因的表達變化及聚類分析，并能發(fā)現(xiàn)一些新的基因。技術發(fā)展到這個階段，RNA測序就成為了一項最基礎的轉(zhuǎn)錄組研究利器。

知識點2：RNA的分類和相關應用

RNA的分類多種多樣，在原核細胞中約80%是rRNA，序列比較保守，與核糖體結(jié)合參與mRNA的翻譯過程，而真正編碼蛋白的mRNA占比不超過5%。真核細胞中也是約80%是rRNA，15%是tRNA，剩下的5%除了mRNA，還有很多調(diào)控mRNA表達的非編碼RNA，如lncRNA，circRNA和小RNA等。這5%就是我們RNA表達測序的主要研究對象，針對不同的研究對象有不同的建庫測序技術。

在建庫技術上，包括全轉(zhuǎn)錄組的測序，mRNA表達譜和轉(zhuǎn)錄組研究，小RNA測序以及一種特異的針對嚴重降解的FFPE類樣本的建庫測序技術，主要研究RNA的外顯子區(qū)域。

知識點3：RNA的測序全流程

RNA富集方法：rRNA比例占比80%以上，且序列保守，如果全部RNA都進行測序會浪費大量數(shù)據(jù)，所以在文庫構(gòu)建前需先進行RNA的富集，一種是正向富集具有polyA尾巴的mRNA，一種是反向去除占比最高的rRNA進行全轉(zhuǎn)錄組測序。

RNA方向性建庫，會在PCR之前加入UDG將二鏈cDNA剪斷，那么就只有cDNA一鏈可進行PCR擴增。

Small RNA建庫：由于片段太小，不能用常規(guī)的RNAseq建庫流程。需要先在small RNA的3‘端加上3’接頭，消化掉多余的3’接頭后再連接5’接頭，用帶有barcode的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄后做PCR擴增，擴增后的產(chǎn)物需要富集純化100-120bp范圍內(nèi)的small RNA片段，華大智造的small RNA建庫試劑盒提供兩種片段選擇的方法，一種是磁珠純化，一種是切膠純化。

RNA exome：直接用總RNA構(gòu)建RNA方向性文庫，得到純化的PCR產(chǎn)物后再用外顯子探針將總RNA中的外顯子區(qū)域捕獲出來，捕獲到的外顯子區(qū)域再進行PCR擴增。

在每一種建庫技術介紹的最后，課程中對每一個建庫對應的數(shù)據(jù)量和推薦的讀長進行了介紹。

知識點4：華大智造RNA類產(chǎn)品選擇

根據(jù)上述的不同RNA測序的應用類型，華大智造都有相應的產(chǎn)品進行覆蓋，課程中對每一個應用類型對應的建庫試劑盒和測序試劑盒一一列出，且對每一個試劑盒的特性進行了介紹。

通過對RNA測序全面的學習，相信您已經(jīng)建立關于RNA測序的總知識面，且對您自身進行RNA測序相關的實驗設計打下牢固基礎。