利用熒光標(biāo)記方法通過(guò)DNA點(diǎn)陣成像獲取堿基信號(hào)，是高通量測(cè)序技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一。華大智造近期重磅發(fā)布的CoolMPS高通量測(cè)序試劑套裝卻顛覆過(guò)往，開(kāi)創(chuàng)性地推出了基于抗體的測(cè)序試劑產(chǎn)品，它使用的dNTPs 未在堿基上標(biāo)記熒光。這一創(chuàng)新，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)損堿基識(shí)別，能夠讓堿基識(shí)別更為清晰。這一測(cè)序試劑套裝也即將于圣誕節(jié)正式開(kāi)售。

那么，它的誕生將帶來(lái)哪些獨(dú)具一格優(yōu)勢(shì)？ 它的數(shù)據(jù)表現(xiàn)如何？

一、優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)、天然、效率高

信號(hào)強(qiáng)、天然及效率高可以概括地反映CoolMPS高通量測(cè)序試劑盒的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)：

首先，它信號(hào)強(qiáng)，每個(gè)抗體能標(biāo)記多個(gè)熒光，堿基信號(hào)更強(qiáng)。每個(gè)抗體分子可以標(biāo)記上多個(gè)熒光分子，相同拷貝數(shù)的DNB，用CoolMPS可以獲得更高的信號(hào)和更高的信噪比，從而使測(cè)序更準(zhǔn)確。圖1顯示了在多個(gè)循環(huán)中使用兩種測(cè)序化學(xué)的強(qiáng)度比較，CoolMPS產(chǎn)品信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)高通量測(cè)序試劑產(chǎn)品。

圖1 測(cè)序時(shí)CoolMPS的信號(hào)強(qiáng)度及隨循環(huán)數(shù)的變化趨勢(shì)

其次，它沒(méi)有非天然堿基帶來(lái)的熒光淬滅，因?yàn)闊晒夥肿訕?biāo)記在抗體上，測(cè)序過(guò)程中無(wú)多余化學(xué)鍵的殘留。在傳統(tǒng)的高通量測(cè)序方法中，聚合的堿基上會(huì)留下多余的化學(xué)鍵，即“疤痕”（圖2），這可能會(huì)影響待測(cè)堿基上的熒光信號(hào)，進(jìn)而影響測(cè)序的準(zhǔn)確性。CoolMPS方法中新合成鏈的堿基為天然堿基，不會(huì)因?yàn)閴A基上的疤痕而影響熒光信號(hào)，最終獲得更高的準(zhǔn)確性和更長(zhǎng)的測(cè)序讀長(zhǎng)。

圖3展示了CoolMPS測(cè)序中，前兩個(gè)堿基對(duì)被測(cè)堿基信號(hào)的影響。堿基上不存在任何疤痕，不論前面兩個(gè)堿基是什么，其A、C、G、T的信號(hào)均相當(dāng)穩(wěn)定。

圖4展示了CoolMPS的測(cè)序錯(cuò)誤類(lèi)型與前一個(gè)堿基的關(guān)系：無(wú)論前一個(gè)堿基是什么，CoolMPS的測(cè)序錯(cuò)誤都非常低，且沒(méi)有明顯的錯(cuò)誤偏好。

圖2 CoolMPS與傳統(tǒng)高通量測(cè)序方法的比較：無(wú)疤痕

圖3 CoolMPS測(cè)序中，前兩個(gè)堿基對(duì)被測(cè)堿基信號(hào)的影響

圖4 CoolMPS與StandardMPS的比較：前兩個(gè)堿基對(duì)被測(cè)堿基信號(hào)的影響

再者，它的反應(yīng)更完全，即DNA聚合天然堿基的效率更高。聚合酶結(jié)合及新加的都是天然堿基， DNA聚合酶在生物體內(nèi)的底物是天然dNTPs。 雖然經(jīng)過(guò)突變體的改造，DNA聚合酶也能加堿基上有龐大熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTPs，但其反應(yīng)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如加堿基上沒(méi)有標(biāo)記的dNTPs。此外每一輪反應(yīng)接近100%的完成率也是進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的必要條件，否則信號(hào)會(huì)呈現(xiàn)指數(shù)下降，產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤。

測(cè)序時(shí)，常用lag及run on指標(biāo)來(lái)反映反應(yīng)是否完全。lag是指測(cè)序進(jìn)行到N位置時(shí)，其某些拷貝才反應(yīng)到N-1位置的比例；而runon則指某些拷貝已反應(yīng)到N+1位置上的比例。我們測(cè)定了用于CoolMPS的測(cè)序酶在加100%的有熒光標(biāo)記堿基的dNTPs與加無(wú)修飾堿基的cold dNTPs的lag與runon，其結(jié)果如圖5所示，加cold dNTPs的平均lag值（0.2%）比加熒光標(biāo)記dNTPs的平均lag值（0.7%）低很多。同時(shí)，加cold dNTPs的平均runon值（0.06%）比加熒光標(biāo)記dNTPs的平均Runon值（0.24%）低很多。CoolMPS技術(shù)的低lag及低runon可能使得測(cè)序讀長(zhǎng)更長(zhǎng)。

圖5 DNA聚合酶對(duì)Cold dNTP與Labeled dNTPs的聚合的lag和runon的效率比較

應(yīng)用數(shù)據(jù)展示

1. CoolMPS PE100測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量及Q30表現(xiàn)優(yōu)異

CoolMPS與StandardMPS的PE100測(cè)序在WGS(PCR)、WGS(PCR-Free)、WES、RNA-Seq和Panel等應(yīng)用上的數(shù)據(jù)顯示：CoolMPS的數(shù)據(jù)產(chǎn)量比StandardMPS高6%，且Q30%比StandardMPS高1~9%。

圖7 CoolMPS PE100數(shù)據(jù)產(chǎn)量和數(shù)據(jù)質(zhì)量表現(xiàn)（Demo數(shù)據(jù)）

2. 應(yīng)用數(shù)據(jù)表現(xiàn)：外顯子、腫瘤Panel、RNA-Seq

針對(duì)三種不同的應(yīng)用數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示CoolMPS測(cè)序數(shù)據(jù)的clean rate和mapping rate表現(xiàn)良好，且覆蓋度均一；CoolMPS檢測(cè)頻率準(zhǔn)確，且與理論頻率的相關(guān)性更高。

-外顯子

樣本：NA12878

建庫(kù)：MGIEasy 外顯子捕獲V5探針試劑套裝

測(cè)序平臺(tái)：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

測(cè)序讀長(zhǎng)：PE100（CoolMPS PE100試劑）

測(cè)序結(jié)果：

對(duì)4個(gè)NA12878樣本的WES數(shù)據(jù)截取100X平均深度的數(shù)據(jù)，采用MegaBolt軟件進(jìn)行了同步分析比較，如表2和圖10所示，CoolMPS測(cè)序數(shù)據(jù)的clean rate和mapping rate表現(xiàn)良好，且覆蓋度均一。

表2 CoolMPS的WES分析結(jié)果

圖8 CoolMPS與StandardMPS的WES數(shù)據(jù)比較

-腫瘤：

樣本：FFPE標(biāo)準(zhǔn)品Horizon HD200

測(cè)序平臺(tái)：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

測(cè)序讀長(zhǎng)：PE100

測(cè)序試劑：CoolMPS & StandardMPS

測(cè)序結(jié)果：

CoolMPS與StandardMPS檢測(cè)頻率均準(zhǔn)確，CoolMPS檢測(cè)與理論頻率的相關(guān)性更高。

表3 CoolMPS與StandardMPS的腫瘤數(shù)據(jù)比較

圖9 CoolMPS與StandardMPS的腫瘤數(shù)據(jù)比較

圖10-1 StandardMPS與理論的突變檢測(cè)頻率的的相關(guān)性

圖10-2 CoolMPS與理論的突變檢測(cè)頻率的的相關(guān)性

-RNA-Seq：

樣本：UHRR標(biāo)準(zhǔn)品

建庫(kù)：MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑套裝

測(cè)序平臺(tái)：MGISEQ-2000(DNBSEQ-G400)

測(cè)序讀長(zhǎng)：PE100

測(cè)序試劑：CoolMPS & StandardMPS

圖11 CoolMPS，StandardMPS及N 平臺(tái)與qPCR的相關(guān)性

CoolMPS，StandardMPS及N 平臺(tái)與qPCR的相關(guān)性，Spearman r=0.866，高度一致。

圖12 CoolMPS，StandardMPS及N 平臺(tái)的相關(guān)性

不同方法或相同方法測(cè)序重復(fù)性均大于0.99。

三、 CoolMPS的測(cè)序原理

大家也許對(duì)CoolMPS的測(cè)序原理依然充滿(mǎn)好奇，它實(shí)質(zhì)上可以理解為聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis，或稱(chēng)為StandardMPS）的升級(jí)版，它使用的核苷酸是堿基上未標(biāo)記熒光的dNTPs（cold dNTPs）。在DNA聚合酶的作用下，cold dNTPs被聚合到測(cè)序鏈，然后通過(guò)和與此cold dNTPs特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗體（圖13）來(lái)實(shí)現(xiàn)堿基識(shí)別。再生后，抗體從測(cè)序鏈上掉落，測(cè)序鏈上新加入的堿基完全是天然的堿基，沒(méi)有任何修飾，如此循環(huán)往復(fù)，完成對(duì)DNA的測(cè)序（圖14）。

圖13 CoolMPS測(cè)序原理

圖14 CoolMPS測(cè)序時(shí)，抗體分子與堿基的結(jié)合

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