Radoje（Rade） Drmanac 博士，華大智造首席科學(xué)家，Complete Genomics 聯(lián)合創(chuàng)始人，人類基因組測(cè)序領(lǐng)域科學(xué)家，他發(fā)明了多項(xiàng)技術(shù)，包括DNA雜交測(cè)序（SBH）、基因組微陣列和納米陣列、聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)和長(zhǎng)片段讀?。↙FR）技術(shù)等。他早年在貝爾格萊德大學(xué)（Belgrade University）獲得分子生物學(xué)學(xué)士、碩士和博士學(xué)位，在倫敦帝國(guó)癌癥研究基金會(huì)的漢斯·萊赫拉的研究小組完成博士后研究，1991年至1994年期間擔(dān)任阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室組長(zhǎng)，1994年，合伙創(chuàng)建Hyseq（后來(lái)的Nuvelo）。

在上一期（華大智造首席科學(xué)家Rade Drmanac: 基因不是命運(yùn)，是微妙的程序（上篇））的采訪中，Rade 談及他如何與測(cè)序技術(shù)結(jié)緣，測(cè)序技術(shù)又為日常生活帶來(lái)哪些變化，本期，他將與大家繼續(xù)分享測(cè)序技術(shù)的未來(lái)發(fā)展情況。

您如何看待未來(lái)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展？

這是一個(gè)非常值得探討的話題，想想我們過(guò)去使用毛細(xì)管甚至凝膠測(cè)序開(kāi)始只能測(cè)少量樣本的時(shí)刻，當(dāng)前測(cè)序技術(shù)已經(jīng)取得了驚人的進(jìn)展。在本世紀(jì)初，我們要花費(fèi)10億美元進(jìn)行全基因組測(cè)序；到了2010年，Complete Genomics第一次在《科學(xué)》 雜志上發(fā)布一次全基因組測(cè)序的材料成本可以降低到五千美元。那時(shí)，還有一批類似Solexa一類的公司在做類似的事情，當(dāng)時(shí)他們的測(cè)序價(jià)格為五萬(wàn)美金?，F(xiàn)在回看，CG所做的事情是巨大的突破，因?yàn)檫@使得測(cè)序成本降低了10倍之多。從那時(shí)候開(kāi)始，測(cè)序成本開(kāi)始數(shù)十倍地降低，我堅(jiān)信未來(lái)測(cè)序成本會(huì)持續(xù)下降，而華大智造會(huì)成為百美金基因組的引領(lǐng)者。

為什么“百美元基因組”如此地重要？這并非指一個(gè)人基因組價(jià)值不超過(guò)一百美元，在我看來(lái)完成一個(gè)人的測(cè)序并且終身使用它，我想這價(jià)值數(shù)萬(wàn)到數(shù)十萬(wàn)美元。但“百美元基因組”背后是人們是否支付得起的問(wèn)題，仍然有很多人無(wú)力為自身極為重要的遺傳信息支付上千美元。

當(dāng)我們有低成本的基因組時(shí)，就可以聚合起巨大的數(shù)據(jù)庫(kù)，多數(shù)時(shí)候人們認(rèn)為百萬(wàn)人口已經(jīng)足夠，但在我看來(lái)應(yīng)當(dāng)是數(shù)十億，類似這樣龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)有助于逆向工程以及對(duì)推動(dòng)我們對(duì)基因程序，對(duì)人類如何運(yùn)行有全方位的理解。人體、基因是個(gè)復(fù)雜的程序，但我們知道但我們知道我可以理解它，以及做逆向工程, 去理解某個(gè)基因的變異所代表的確切含義。因此，要做這種大規(guī)模的項(xiàng)目，我們需要非常龐大的組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，然后也包括人工智能。

測(cè)序技術(shù)的未來(lái)一定是進(jìn)一步地降低成本，提高通量和質(zhì)量。我想MGISEQ-T7就是達(dá)成這個(gè)未來(lái)的絕佳范本，未來(lái)華大智造也不會(huì)止步于此。華大智造DNBSEQ?是當(dāng)今最好的大規(guī)模并行高通量技術(shù)之一，因?yàn)镈NA納米球非常小，直徑大約只有200納米，所以我們可以排布更高密度的陣列，在同一表面上承載更多信息。MGISEQ-T7上納米球的間距大約是700納米之后我們會(huì)不斷縮短間距，只有這樣才能在同樣面積的載片上、同樣體積的試劑上，獲取更多的信息。TB (Terabase) 級(jí)別的測(cè)序成本已經(jīng)變得越來(lái)越低。除此之外，納米球在200納米內(nèi)有300份拷貝，相對(duì)于PCR簇，擁有更高的信噪比。

測(cè)序技術(shù)發(fā)展的另外一個(gè)方向一定更注重測(cè)序的質(zhì)量。目前我們所用的標(biāo)記核苷酸和聚合酶在聚合時(shí)存在一定的困難。雖然我們優(yōu)化的酶做得很好，盡管如此，有時(shí)標(biāo)記核苷酸和聚合酶之間仍有沖突，特別是去除熒光染料時(shí)。會(huì)有一些原子如同一道疤痕留在堿基中，這樣就不再擁有無(wú)損堿基。

因此在幾年前，我們提出了一種全新的測(cè)序方式，一個(gè)新的化學(xué)方法，在這個(gè)方法中，我們將未標(biāo)記的核糖核酸與四色熒光標(biāo)記來(lái)識(shí)別堿基，沒(méi)有任何標(biāo)記，也沒(méi)有堿基修飾，我們將這個(gè)技術(shù)稱作“CoolNGS”或者是”CoolMPS (cool massively parallel sequencing)”?！癱ool” 意味著我們不必使用帶有標(biāo)記（hot）的核苷酸, 而是使用未標(biāo)記（cold）的核苷酸。當(dāng)我跟喬治· 丘奇和其他科學(xué)家描述這個(gè)化學(xué)方法的時(shí)候，他們?yōu)檫@樣的想法感到興奮。在我描述這一切的時(shí)候，他們覺(jué)得“ 很酷（cool）！” 這就是CoolNGS (CoolMPS) 名字的由來(lái)。我想，這是代表高通量測(cè)序技術(shù)未來(lái)發(fā)展方向的一個(gè)例子，我們已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明這一技術(shù)能夠極大地提升測(cè)序的讀長(zhǎng)與精準(zhǔn)度。在提高精確度以及提供高通量、低成本的測(cè)序之后，所需要做的就是開(kāi)發(fā)更多的應(yīng)用。

我們擁有很多的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槲覀冊(cè)谏蒁NA納米球時(shí)不使用PCR，我們使用的是滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，在滾環(huán)復(fù)制中，具有鏈置換功能的RCA聚合酶始終基于原始模板進(jìn)行數(shù)百次的拷貝，我們的技術(shù)不是傳遞復(fù)制，這也是唯一不產(chǎn)生克隆錯(cuò)誤的高通量測(cè)序技術(shù)。這些克隆錯(cuò)誤是可以被檢測(cè)的，如果在一個(gè)納米球的300份拷貝中有一份出現(xiàn)錯(cuò)誤，沒(méi)有關(guān)系，我們可以從其他299份中檢測(cè)到正確的信號(hào)。

現(xiàn)在我們擁有“真“、”正“ PCR-free的技術(shù)”，結(jié)合PCR-Free文庫(kù)制備方法，首次實(shí)現(xiàn)了PCR-Free的全基因組測(cè)序。接下來(lái)，會(huì)有更多的應(yīng)用采用這種真正的PCR-Free測(cè)序技術(shù)，例如RNAseq或者微生物組。為什么DNBSEQ?技術(shù)能夠做到真正的PCR-Free測(cè)序? 原因是DNB加載到陣列式載片的效率極高。在測(cè)序文庫(kù)制備過(guò)程中，80%的文庫(kù)分子可以環(huán)化成單鏈環(huán)狀DNA， 其中95%的單鏈環(huán)狀DNA可以生成DNBs， 然后90%的DNBs可以被加載到測(cè)序芯片上。這樣，超過(guò)50%的原始模板分子可以被測(cè)到。正因如此，我們完全無(wú)需擴(kuò)增模板分子的步驟, 就可以直接對(duì)原始模板進(jìn)行環(huán)化，生成DNBs并測(cè)序。

該技術(shù)有望在其他類型的文庫(kù)中得以應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)全流程無(wú)PCR的測(cè)序。基于DNBSEQ?平臺(tái)的PCR-Free文庫(kù)也不需要分子標(biāo)簽（unique molecular identifiers，UMIs）。UMIs主要的作用是為了避免PCR建庫(kù)和PCR-cluster過(guò)程中引入的錯(cuò)誤。由于PCR-Free的DNBSEQ?技術(shù)保證了每條read都是保真可用的，因此不需要使用UMIs來(lái)矯正PCR引入的錯(cuò)誤。此外，由于DNBSEQ?技術(shù)使得標(biāo)簽跳躍（index hopping）發(fā)生的概率遠(yuǎn)低于其他測(cè)序平臺(tái)，可以將上百個(gè)文庫(kù)pooling到一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中，尤其適用于高通量樣本的測(cè)序。

我們還開(kāi)發(fā)了stLFR技術(shù)。這是我們幾年前提出的強(qiáng)大的分子標(biāo)簽技術(shù)，用于長(zhǎng)片段DNA信息獲取。當(dāng)前我們能夠以較低的成本對(duì)數(shù)十億的片段進(jìn)行測(cè)序，準(zhǔn)確度雖高，但相對(duì)讀長(zhǎng)較短。所以，我們的想法是想以一種新的方式來(lái)進(jìn)行高通量大規(guī)模并行測(cè)序，大家都知道，即使我們一次能夠讀500bp，長(zhǎng)度仍然相對(duì)較短。因此，該技術(shù)的作用是使用長(zhǎng)片段，例如100kb，200kb，在片段化的過(guò)程中添加測(cè)序分子標(biāo)簽，使來(lái)自該長(zhǎng)分子的每個(gè)亞片段具有相同的分子標(biāo)簽。

我們將這個(gè)過(guò)程稱之為共標(biāo)記（co-barcoding），因?yàn)閬?lái)自同一個(gè)長(zhǎng)分子的所有小片段都獲得相同的分子標(biāo)簽。這些子片段具有相同分子標(biāo)簽的。我們的stLFR技術(shù)，使我們第一次擁有幾乎無(wú)限數(shù)量的分子標(biāo)簽，我們?cè)谖⒅樯蟿?chuàng)造了30億個(gè)這樣的分子標(biāo)簽，我們從三十億個(gè)中選出上億個(gè)分子標(biāo)簽，將他們與來(lái)自同一個(gè)樣本的近千萬(wàn)條長(zhǎng)DNA片段放在一個(gè)管內(nèi)。

幾乎每個(gè)長(zhǎng)片段都會(huì)得到自己獨(dú)特的分子標(biāo)簽，因?yàn)槲覀冇懈嗟姆肿訕?biāo)簽而不是長(zhǎng)片段，一千萬(wàn)個(gè)條碼就有一千萬(wàn)個(gè)長(zhǎng)片段。這是我們第一次可以擁有獨(dú)特的共標(biāo)記， stLFR可以說(shuō)是表現(xiàn)最佳的分子標(biāo)簽技術(shù)。它操作更為簡(jiǎn)單，不需要用油包水體系或特定儀器支持。它也很便宜, 實(shí)際上就像制作一個(gè)略高級(jí)的常規(guī)文庫(kù)。但是，這種獨(dú)特的分子標(biāo)簽首次允許我們做的是真正有效的單倍型-從頭組裝個(gè)人基因組。它可以提供臻于“完美”的基因組。現(xiàn)在我們可以很輕易地對(duì)數(shù)百個(gè)新物種，比如鳥(niǎo)類，動(dòng)物和植物進(jìn)行測(cè)序和基因組組裝，不需要像以前一樣花費(fèi)一整年不停地構(gòu)建各種不同的Mate-pair文庫(kù)（配對(duì)大片段文庫(kù)）。

我們可以看到stLFR技術(shù)催生了這類應(yīng)用，加上納米球，規(guī)則陣列，更好的CoolMPS化學(xué)方法集合到一起，給我們帶來(lái)更高的質(zhì)量，更低的成本，和更高的通量。影響精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的限制因素不會(huì)是DNA測(cè)序技術(shù)，這些限制有可能來(lái)自物流，醫(yī)生問(wèn)診或樣品采集，我始終相信我們?cè)跍y(cè)序上將有無(wú)限的可能。