隨著疫情進(jìn)入攻堅階段，基于實(shí)時熒光RT-PCR法的核酸檢測技術(shù)在新冠病毒快速鑒定及確診中發(fā)揮了重要作用。然而，若要對新冠病毒來源、變異進(jìn)化及致病機(jī)理等進(jìn)行研究，需獲取完整的病毒基因組信息，這離不開高通量測序和病毒序列組裝。

為全面深入地揭示新冠病毒的相關(guān)特性，華大智造可為新型冠狀病毒高通量測序、序列組裝、變異進(jìn)化分析等流程提供一體化檢測平臺，并已協(xié)助全國多地疾控中心成功組裝新型冠狀病毒全長序列。結(jié)果顯示，它們與公布的參考基因組序列高度一致。

新冠病毒序列組裝過程中的難點(diǎn)及要求

如大家所知，高通量測序在新冠病毒鑒定及診斷中可與RT-PCR法形成互補(bǔ)，不僅能提高陽性檢出率，還能進(jìn)行并發(fā)檢測，提供更多可能感染的病原信息。更為重要的是，它還可以對病毒序列進(jìn)行組裝，獲得病毒全長基因組信息，為追溯病毒來源、監(jiān)測病毒變異趨勢、探究致病機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。

為獲取完整的病毒基因組序列，目前廣泛應(yīng)用的高通量測序技術(shù)是將核酸序列打斷成短片段進(jìn)行測序，然后通過分析軟件將測得的短序列進(jìn)行拼接組裝。然而，新型冠狀病毒作為一種新發(fā)病毒，人們在測序深度、測序準(zhǔn)確性、重復(fù)序列比例等方面，還沒有形成具有參考意義的經(jīng)驗值。如果要將海量的短序列還原出原始的基因組序列，則會在序列拼接中出現(xiàn)以下問題：

首先，難免出現(xiàn)測序錯誤，導(dǎo)致某些重疊可信度低；其次，基因組序列的不完全覆蓋性以及高重復(fù)序列的干擾，會影響拼接的準(zhǔn)確性和完整性；最后，宏轉(zhuǎn)錄組測序樣本中的人源序列占85%以上，病原序列僅占5%左右，這使得病毒基因組序列拼接難度更高。

圖1 序列拼接組裝難點(diǎn)及其對測序平臺的要求

優(yōu)化測序策略，確保病毒序列信息完整性

為破解上述新冠病毒序列在組裝過程中遇到的難題，華大智造可提供含建庫、高通量測序、序列組裝、變異進(jìn)化分析等流程在內(nèi)的一體化解決平臺。

在建庫環(huán)節(jié)中，為避免樣本在采樣、保存和運(yùn)輸過程中因不確定性導(dǎo)致提取的核酸含量出現(xiàn)較大差異，華大智造可提供兩種解決策略：一是對核酸含量高的樣本建議進(jìn)行rRNA去除再建庫，提高有效數(shù)據(jù)占比；二是對核酸含量低的樣本，直接進(jìn)行RNA建庫，減少核酸損失，提升建庫成功率，并加大測序深度。

其次，在測序環(huán)節(jié)采用華大智造MGISEQ-200測序儀，它不僅小巧靈活，同時高效專注，已協(xié)助全國多地疾控中心完成鑒定并成功拼接出各地首例新冠病毒序列。

最后，通過病原鑒定系統(tǒng)對新冠病毒序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并采用IDBA方法完成拼接。

這樣，即使是在未去除宿主的情況下，也可以滿足宏轉(zhuǎn)錄組測序病毒序列組裝對數(shù)據(jù)量的要求，保證序列信息的完整性。

圖2 針對新型冠狀病毒序列組裝的解決策略

實(shí)例解析新冠病毒全基因組序列獲取全流程

接下來，我們將以某疾控中心收到的1例新冠病毒肺炎疑似樣本為例，為您解析該CDC首例新型冠狀病毒感染病例呼吸道標(biāo)本宏轉(zhuǎn)錄組測序及病毒序列組裝全流程：

新冠病毒全基因組序列獲取全流程

2020年1月20日 - 1月22日上午

1月20日，文庫制備

針對核酸量不同的樣本，團(tuán)隊分別采用了不同的建庫策略，并使用MGIEasy RNA文庫制備試劑套裝進(jìn)行建庫。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、接頭連接、PCR擴(kuò)增、純化等一系列操作后獲得文庫產(chǎn)物，再使用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，制備DNA納米球。

圖4 MGIEasy RNA文庫制備試劑套裝

1月21日，上機(jī)測序

基于MGISEQ-200平臺，對該地發(fā)現(xiàn)的首例病例的呼吸道標(biāo)本進(jìn)行300M的高深度測序。

1月22日上午，數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)出32Gb數(shù)據(jù)，總reads數(shù)318M。結(jié)合病原感染快速鑒定系統(tǒng)，鑒定出2,337,442條新型冠狀病毒reads。

1月22日上午，拼接組裝

分析軟件自動將2,337,442條的新型冠狀病毒reads從所有序列中抽出。使用拼接效率高的IDBA方法進(jìn)行組裝，成功完成新型冠狀病毒的序列組裝，獲得基因組序列全長29.9kb。

圖7 病毒基因組序列拼接組裝流程

知己知彼，百戰(zhàn)不殆。盡管我們對新型冠狀病毒的認(rèn)識有待進(jìn)一步研究，但通過宏轉(zhuǎn)錄組測序和病毒序列組裝獲得新型冠狀病毒全基因組序列，有助于揭示病毒相關(guān)特性。通過對全基因組序列相似性比較和變異位點(diǎn)分析，可以為構(gòu)建進(jìn)化圖譜、追溯病毒來源、追蹤變異路徑、了解致病機(jī)理等提供重要參考信息，助力抗擊疫情。