近日，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》。新版診療方案主要調(diào)整了以下內(nèi)容：防疫形勢(shì)提示警惕境外輸入病例；傳播途徑增加“應(yīng)注意糞便及尿?qū)Νh(huán)境污染造成氣溶膠或接觸傳播”；增加對(duì)孕產(chǎn)婦和兒童的臨床表現(xiàn)描述；增加疑似病例排除標(biāo)準(zhǔn)……其中，診斷標(biāo)準(zhǔn)在已有的兩種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法（RT-PCR核酸檢測(cè)和病毒基因測(cè)序）的基礎(chǔ)上，新增“血清新型冠狀病毒特異性lgM和lgG抗體作為病原學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)之一”。

關(guān)于指南中提出的這幾種方法，它們之間到底有怎樣的差異，在實(shí)際應(yīng)用中需要哪些工具和平臺(tái)才能夠順利展開(kāi)檢測(cè)呢？我們一起來(lái)了解：

探究新冠病毒檢測(cè)方法

方法1：實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的特點(diǎn)是非?？焖?，其檢測(cè)原理是針對(duì)要識(shí)別病毒的特異性核酸序列，設(shè)計(jì)特定的引物和探針。目前市場(chǎng)上的試劑盒大多都是識(shí)別RdRp基因，即圍繞病毒核酸復(fù)制表達(dá)那一部分的基因設(shè)計(jì)探針。

在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的復(fù)制過(guò)程中，通過(guò)探針識(shí)別出病毒的這一部分序列，然后通過(guò)PCR將病毒的序列復(fù)制放大，在放大的過(guò)程中，在反應(yīng)體系中加入染料，并實(shí)時(shí)捕獲信號(hào)，最后通過(guò)qPCR附帶的軟件來(lái)計(jì)算Ct值，用于檢測(cè)結(jié)果分析。

理論上這種方法非常靈敏，只要有一個(gè)病毒的核酸被識(shí)別出來(lái)，就都可以被放大，這個(gè)過(guò)程循環(huán)數(shù)越小，曲線提升越明顯，意味著病毒的載量越高，所以是一種目的性非常強(qiáng)的特異性的方法。

方法2：病毒基因測(cè)序

如果說(shuō)熒光RT-PCR方法像是在池塘里釣魚(yú)，那么對(duì)樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序就類似于用一張大網(wǎng)將池塘中所有的魚(yú)一網(wǎng)撈盡，把樣本中人類的基因、病毒基因和其他微生物的基因都識(shí)別出來(lái)。

宏基因組測(cè)序方法檢測(cè)更全面，敏感度高，特別是對(duì)于多重感染，如肺炎患者可能還同時(shí)感染甲型、乙型流感、支原體、鼻病毒等，也能通過(guò)宏基因組測(cè)序識(shí)別出來(lái)，但全流程時(shí)間比RT-PCR方法更長(zhǎng)一些。此外，在病毒載量低于RT-PCR最低檢出限及人源宿主背景較低的情況下，也可以通過(guò)高深度的測(cè)序來(lái)實(shí)現(xiàn)特異性的識(shí)別。

此外，還可以基于多重PCR靶向Panel的高通量測(cè)序方法獲取SARS-CoV-2病毒全長(zhǎng)基因組。這種方法可以在高通量測(cè)序的同時(shí)完成多個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)。

具體流程上，測(cè)序方法是在提取核酸之后，進(jìn)行文庫(kù)制備，隨后進(jìn)入測(cè)序儀測(cè)序得到序列信息，經(jīng)過(guò)背景數(shù)據(jù)過(guò)濾后，將其比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)上，從而獲取病毒完整的reads，最后組裝成完整的基因組序列。

圖1  華大智造DNBSEQ-T7在1月3日完成新冠病毒全基因組序列組裝

方法3：血清學(xué)檢查

血清學(xué)檢查方法，操作簡(jiǎn)單方便，最快15分鐘內(nèi)出結(jié)果。但試劑靈敏度和特異性還比較有限，適用于大量疑似病例和無(wú)癥狀感染者檢測(cè)。因此目前我國(guó)在抗疫中廣泛采用的是核酸檢測(cè)。

熒光RT-PCR、高通量測(cè)序和血清學(xué)檢查這三種方法各有側(cè)重，不能相互替代。將多種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，可有效縮短檢測(cè)窗口期，提高陽(yáng)性檢出率。

盤點(diǎn)新冠病毒檢測(cè)方法 

圍繞新冠病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，下面我們從一站式、自動(dòng)化和高通量等幾個(gè)層面展開(kāi)探討。

熒光RT-PCR核酸檢測(cè)與高通量測(cè)序這兩種方法比較類似：實(shí)驗(yàn)室接收到樣本之后，都要先對(duì)樣本進(jìn)行滅活處理，然后使用提取試劑盒提取出樣本的核酸，根據(jù)不同的檢測(cè)方式，RT-PCR會(huì)做反應(yīng)體系的配置，而高通量測(cè)序則有文庫(kù)制備的過(guò)程，接下來(lái)就進(jìn)入各自的儀器，進(jìn)行核酸序列的檢測(cè)，隨后系統(tǒng)會(huì)進(jìn)行自動(dòng)化的判定和結(jié)果輸出。

其中，兩種方法的樣本提取、體系配置或建庫(kù)等這些中間步驟的手工操作過(guò)程，都可以用自動(dòng)化設(shè)備來(lái)完成，且更安全更快速。

圖2  華大智造新冠病毒實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品

不同檢測(cè)流程如何配置設(shè)備

那么具體到不同檢測(cè)流程，如何配置實(shí)驗(yàn)室設(shè)備呢？以華大智造為例：

對(duì)于RT-PCR的檢測(cè)方法，一臺(tái)MGISP-960一小時(shí)處理96個(gè)樣本核酸提?。壳耙焉?jí)到80分鐘處理192個(gè)樣本），理論上一天8小時(shí)可以處理500-1000例樣本；而常見(jiàn)熒光PCR儀以平均12小時(shí)處理700例樣本估算，兩臺(tái)設(shè)備可采用1:1配置。同時(shí)華大智造也提供適配的試劑盒，包括核酸提取試劑盒以及熒光PCR體系配置的核酸檢測(cè)試劑盒，可穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)至少每天500例的樣本處理能力。

表1  RT-PCR核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，500-1000例樣本/天

對(duì)于高通量測(cè)序（宏基因組）檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)樣本量的限制主要是基因測(cè)序儀。以目前華大智造通量最大的DNBSEQ-T7為例，1天可以處理最多128例樣本（數(shù)據(jù)量＞80M reads），因此上游可以配置4臺(tái)MGISP-100或2臺(tái)MGISP-960，完成從提取到建庫(kù)的自動(dòng)化流程，適配試劑盒可整套一起打包。

表2  高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)室設(shè)備，100-200例樣本/天

對(duì)于高通量測(cè)序（靶向）檢測(cè)方法，其原理是自動(dòng)化提取+多重PCR靶向測(cè)序。不同于一網(wǎng)打盡的宏基因組測(cè)序，這種方法通過(guò)針對(duì)新冠病毒的特殊檢測(cè)試劑盒，在測(cè)序前的樣本制備中，先把新冠病毒的基因撈出來(lái)，然后再進(jìn)行測(cè)序。這種方法兼具宏基因組測(cè)序和RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)，在得到病毒基因組全序列的同時(shí)，測(cè)序樣本量可以提高10-20倍。

圖3  華大智造新冠病毒檢測(cè)試劑盒（多重PCR測(cè)序Panel）

在此基礎(chǔ)上，通過(guò)內(nèi)參還可以相對(duì)定量地判斷病毒載量，更加適用于大量樣本情況下的疫情檢測(cè)和病毒變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究。目前，華大智造已推出基于該方法的檢測(cè)試劑盒（即多重PCR測(cè)序Panel）。