隨著新冠病毒的全球肆虐，如何在針對疑似樣本的大規(guī)模檢測中，既能提高檢測靈敏度，又能獲得完整的病毒全基因組序列以用于后續(xù)變異監(jiān)測和研究？近日，中國科學(xué)家預(yù)印在bioRxiv的一篇文章《Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples》給出了答案。

研究采用宏基因組測序（Meta）、探針捕獲測序（Capture）和多重PCR擴增子測序（Amplicon）三種方法分別對8例梯度稀釋的病毒培養(yǎng)物（Ct值17.3-39.9）和8例新冠病毒臨床樣本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液樣本）基于DNBSEQ平臺進行了檢測。其中，采用宏基因組方法對臨床樣本進行了超高通量測序，每個樣本產(chǎn)出數(shù)據(jù)大于300Gb，但在總Reads中的病毒Reads僅占0.002%-5.513%；而采用探針捕獲測序方法和多重PCR擴增子測序方法則能將這一比例提高數(shù)十至數(shù)萬倍。除此之外，研究團隊還從不同方法對樣本數(shù)據(jù)量的要求、不同病毒載量檢測靈敏度及突變檢測準確性等多方面展開了進一步的對比和分析。

樣本數(shù)據(jù)量要求

在同時滿足全基因組覆蓋度95%以及10X測序深度的情況中：針對8例病毒梯度稀釋樣本(102-106 copies/ml)進行探針捕獲測序需要5.3Mb-14Gb數(shù)據(jù)，進行多重PCR擴增子測序需要33Mb-973Mb數(shù)據(jù)；針對8例臨床樣本，進行探針捕獲測序需要12Mb-25Gb數(shù)據(jù)，進行多重PCR擴增子測序需要32Mb-1.8Gb數(shù)據(jù)，而宏基因組需要129Mb-334Gb數(shù)據(jù)。

表1 在10X測序深度下三種方法所需要的數(shù)據(jù)量 (全基因組覆蓋度95%)

在滿足高質(zhì)量下游分析的情況下(捕獲≥20X，多重≥100X，宏基因組≥10X，覆蓋度≥95%)：針對8例病毒梯度稀釋樣本(102-106 copies/ml)的探針捕獲測序需要8Mb-24Gb數(shù)據(jù)，多重PCR擴增子測序需要185Mb-2.7Gb數(shù)據(jù)；而針對8例臨床樣本的探針捕獲測序需要23Mb-25Gb數(shù)據(jù)，多重PCR擴增子測序需要261Mb- 1.8Gb數(shù)據(jù)，而宏基因組則需要129Mb-334Gb數(shù)據(jù)。

表2 滿足深度分析要求的三種方法所需要的數(shù)據(jù)量

通過以上對比可知，在低病毒載量樣本中，多重PCR擴增子測序方法所需數(shù)據(jù)量最少，而且在不同病毒載量樣本中所需要的數(shù)據(jù)量差異較小。

病毒載量檢測靈敏度

在DNBSEQ平臺，采用華大智造SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel試劑盒，對梯度稀釋的病毒培養(yǎng)物（Ct值17.3-39.9）和臨床樣本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液樣本）分別進行檢測，結(jié)果表明：對于高病毒載量（≥105 copies/ml），探針捕獲測序和多重PCR擴增子測序都有很好的富集效果（平均每個樣本相對于宏基因組方法分別獲得了5596倍和5710倍富集）；而在低病毒載量的樣本中（≤104 copies/ml，Ct值≥28.7）多重PCR擴增子測序的富集效果是探針捕獲測序的10-1000倍。這一結(jié)果表明，在低病毒載量的情況下，多重PCR擴增子測序具有更好的檢測靈敏度。

#RPM-每M數(shù)據(jù)中病毒read的數(shù)量 圖1 三種方法對病毒富集的效果

突變檢測準確性

針對8例臨床樣本，研究發(fā)現(xiàn)，基于多重PCR擴增子測序和宏基因組測序方法都可以檢測到19個突變位點，而探針捕獲測序只能檢測到18個位點，漏檢一個點，并且該位點對應(yīng)的樣本病毒載量低（Ct 值30）。這一結(jié)果表明：多重PCR擴增子測序方法相對更為準確，特別是在樣本病毒載量極低的情況下。

圖2 三種方法突變檢測結(jié)果

結(jié)論

綜上，基于高通量測序技術(shù)的三種方法在新冠病毒檢測的應(yīng)用中，可供參考的建議如下：

1. 如果研究人員希望研究包括目標微生物在內(nèi)的所有可能感染的病原微生物，而樣本病毒載量≥105 copies/ml或Ct值≤ 24.5，推薦宏基因組測序方法；

2. 如果研究人員只針對目標微生物展開探討，而且面臨的樣本比較具有挑戰(zhàn)性，譬如病毒載量<105 copies/ml或Ct值>24.5，那么：當(dāng)研究人員較為關(guān)注的是次要堿基突變和堿基頻率時，推薦探針捕獲測序方法；當(dāng)研究人員較為關(guān)注的是主要堿基突變時，則推薦多重PCR擴增子測序方法；

3. 如果研究人員只針對目標微生物展開探討，關(guān)注的重點是主要堿基突變，而且面臨的樣本極具挑戰(zhàn)性：病毒載量低至102 copies/ml或Ct值高至35，推薦多重PCR擴增子測序方法。

目前，針對以上三種方法，華大智造DNBSEQ平臺均已推出配套整體解決方法。特別地，在該文中采用的SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel試劑盒基于華大智造ATOPlex多重定制化服務(wù)平臺打造。該試劑盒除了應(yīng)用于全基因組組裝、病毒變異檢測、進化研究外，還能夠應(yīng)用于極端新冠樣本的檢測，最低僅需1M Reads就可獲取病毒全基因組信息，其表現(xiàn)出比常規(guī)RT-PCR更高的靈敏度，能夠滿足RT-PCR假陰性樣本的二次檢測、復(fù)核確診和大規(guī)模疑似樣本檢測的需要。

關(guān)于SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel試劑盒

• 基于華大智造ATOPlex多重定制化服務(wù)平臺打造的定制Panel；

• 基于鎖定引物的2步PCR，特異性強，中間不需要額外的消化步驟，操作簡單；

• 能夠在一管中實現(xiàn)病毒全基因的擴增，不需要分管操作；

• 加入已知拷貝數(shù)人工合成外參DNA，并同時進行病毒基因和外參DNA的檢測，用于病毒的載量確定；

• 加入看家基因檢測，可以用于病毒載量相對于細胞含量的確定，有助于病毒細胞病理學(xué)研究；

• 雙唯一Barcode結(jié)合DNBSEQ測序，最大程度地降低了Barcode串?dāng)_，降低了在大規(guī)模平行測序過程中強陽性樣本對弱陽性或陰性樣本的污染。

關(guān)于ATOPlex多重PCR定制化服務(wù)平臺

ATOPlex多重PCR定制化服務(wù)平臺是華大智造自主研發(fā)的以超高重PCR技術(shù)為核心的產(chǎn)品定制平臺。該平臺涵蓋了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可以滿足科研、醫(yī)藥、司法、農(nóng)業(yè)、DTC等相關(guān)領(lǐng)域的個性化基因檢測產(chǎn)品定制。ATOPlex多重PCR定制產(chǎn)品平臺提供產(chǎn)品設(shè)計、建庫試劑。此外，還可以提供定制化產(chǎn)品基于MGISP-100或者MGISP-960的自動化建庫解決方法。