成果簡介

近日，澳大利亞昆士蘭大學水管理高等研究中心（AWMC, The University of Queensland）和華大在Environmental Science & Technology Letters上發(fā)表題為“Novel Multiplexed Amplicon-Based Sequencing to Quantify SARS-CoV-2 RNA from Wastewater”的研究論文。文章介紹了一種基于多重擴增子的測序方法（Multiplexed Amplicon-based Sequencing）來實現(xiàn)城市污水中SARS-CoV-2 RNA的精確檢測。值得一提的是，該研究采用了華大智造全面、靈活且高效的MGISEQ-2000基因測序儀，以及ATOPlex多重PCR定制化平臺來完成。

和常規(guī)的RT-qPCR相比，該方法不僅能夠?qū)π鹿诓《具M行高靈敏度檢測，還能準確獲取病毒載量信息和病毒基因組信息，利用這些信息可以對城市疫情流行程度進行判斷并對大流行的新冠病毒變種進行溯源。此外，研究結(jié)果表明城市污水中的固相懸浮物或顆粒物中亦含有大量的SARS-CoV-2 RNA。該研究有望進一步推進基于污水流行病學在公共衛(wèi)生應(yīng)急方面的應(yīng)用。

引言

當前由于SARS-CoV-2引起的新冠肺炎全球大流行是國際社會廣受關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。截止到7月12日，全球范圍內(nèi)已經(jīng)有超過1.8億人感染，并造成了超過四百萬死亡病例。非藥物性的干預，包括社交距離、佩戴口罩、及時隔離感染者和密切接觸者、以及限制人類活動范圍，被各國政府所采納以減緩新冠病毒社區(qū)傳播。

然而，因為不少的病毒攜帶者屬于無癥狀患者，通過臨床驗測來衡量社區(qū)內(nèi)病毒的流行程度有一定的局限性和滯后性。最新的研究進展表明，基于污水的流行病學研究（Wastewater-Based Epidemiology, WBE）可在早于醫(yī)療系統(tǒng)檢測的時間點發(fā)現(xiàn)病毒的存在，同時不受無癥狀感染者的干擾，這為新冠疫情的管控從另一層面提供了新的預警信息，并能幫助相關(guān)部門更加有效地做出公共衛(wèi)生決策。

隨著COVID-19的大流行，WBE日益受到各國政府衛(wèi)生機構(gòu)和研究團隊的關(guān)注。但是由于SARS-CoV-2在污水中的濃度很低，如何準確、靈敏和高通量檢測城市污水中的SARS-CoV-2依然面臨挑戰(zhàn)。

目前的檢測方法主要有哪些呢？

目前常規(guī)檢測方案多數(shù)基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），如反轉(zhuǎn)錄實時熒光PCR （RT-qPCR）和以及反轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字PCR （RT-ddPCR）。RT-qPCR和RT-ddPCR雖然很靈敏，但由于城市污水管網(wǎng)是一個龐大而且復雜的體系，RNA在污水中會被高度稀釋和降解。另一方面，RNA病毒極不穩(wěn)定，從而從環(huán)境中得到高質(zhì)量的基因組相當困難。RT-qPCR和RT-ddPCR一般使用的N1/N2/N3擴增引物，相對于病毒基因組（～30000bp）覆蓋區(qū)域低于1%。這意味著假如引物靶位RNA序列被降解，會造成假陰性結(jié)果（脫靶）。

你也許會想宏轉(zhuǎn)錄組（Metatranscriptomics）檢測手段是否可行？與基于PCR的方法相比，宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的優(yōu)勢在于它可以捕獲到環(huán)境中的所有RNA病毒片段，從中可以得到SARS-CoV-2的基因序列?？墒牵捎诓《绢w粒在離開人體進入城市污水管網(wǎng)之后會被高度稀釋和降解，降解的病毒片段會和其他污水微生物（sewagemicrobiome）參雜在一起。所以要想采用宏轉(zhuǎn)錄組定量污水中SARS-CoV-2，需要對城市污水樣本完成超深度的測序（ultra-deepsequencing），這意味著大量資金投入，并需要后續(xù)搭配高度專業(yè)化的生物信息分析流程。

可以看出，一個成本低、效率高的測序方法顯得很有必要。多重 PCR測序技術(shù)（MultiplexedAmplicon-based Sequencing）是在常規(guī) PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種新型測序技術(shù)，能夠同時對多個靶位進行檢測，不僅節(jié)省了時間和成本，更能從有限的基因組中提取大量的信息。ATOPlex是華大智造（MGI）開發(fā)的多重PCR技術(shù)平臺，通過使用多重混合引物捕獲新冠病毒全基因組序列信息，可實現(xiàn)對低濃度病毒的富集和高通量測序。這個新的測序方法操作流程簡單（見圖1），既有極高的靈敏度，又能夠精準定量病毒，還能獲取完整的基因組信息，從而實現(xiàn)病毒檢測、定量和溯源分析。

圖1. 城市污水新冠病毒檢測流

結(jié)果與討論

ATOPlex可實現(xiàn)更靈敏的病毒定量

同時對梯度稀釋的陽性樣品進行RT-ddPCR絕對定量和ATOPlex測序，ATOPlex獲得的新冠reads數(shù)量比例（SARS-CoV-2/Spike-incontrol）與病毒濃度成高度正相關(guān)（R2 = 0.993），病毒序列的比例可以很好的代表病毒含量。

圖2.ATOPlex和RT-ddPCR相關(guān)性分析

此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，ATOPlex技術(shù)比常規(guī)的RT-qPCR更加靈敏。當病毒含量在RT-qPCR檢測限附近，RT-qPCR可能會給出假陰性，但ATOPlex可以穩(wěn)定地獲取病毒基信息，并且能夠獲取96.9%的基因組信息，甚至在病毒濃度低于檢測限一個數(shù)量級時，ATOPlex仍然可以回收到8.4%的病毒基因組（見表1）。所以ATOPlex技術(shù)可以更靈敏地檢測污水中低濃度的病毒。

表1. ATOPlex和qPCR對N1和N2引物檢測的標準偏差比較（陽性對照品稀釋系列）

ATOPlex可實現(xiàn)病毒溯源分析

RT-qPCR只能給出定量信息，然而ATOPlex測序技術(shù)能夠盡可能的恢復病毒的基因組信息，從而準確、快速的對病毒變種進行溯源。針對陽性樣品基因組的系統(tǒng)進化學研究分析發(fā)現(xiàn)，在病毒濃度低于RT-qPCR檢測極限四分之一的條件下，溯源的結(jié)果依然準確（圖3）。

圖3.陽性樣本系統(tǒng)發(fā)育分析

城市污水中的顆粒物中可能藏有大量病毒

以往大多數(shù)的WEB都是根據(jù)污水中的液相部分進行提取和檢測，忽略了污水中固相懸浮物中吸附的病毒顆粒。使用RT-qPCR和ATOPlex技術(shù)對RNA提取物進行分析的結(jié)果表明，固相中的病毒信號強度甚至高于液相部分（圖4）。城市污水中的顆粒或固態(tài)物質(zhì)可能藏有大量的病毒，在WEB分析中不可忽視。

圖4.污水中病毒含量固相高于液相.A：六個真實污水樣品液相和固相病毒濃度對比。B：樣品基因組覆蓋率

總結(jié)

該研究成功將基于多重擴增子測序的新方法（即ATOPlex 技術(shù)平臺）成功應(yīng)用于檢測城市污水中的SARS-CoV-2。該方法能實現(xiàn)對污水中SARS-CoV-2的高度敏及高通量定量分析，并可溯源病毒系統(tǒng)發(fā)育信息，從而有利于WBE 在公共衛(wèi)生應(yīng)急方面的進一步應(yīng)用和發(fā)展。

同時，這項技術(shù)每個樣本所使用的引物、PCR條件，以及生物信息分析手段都向社會公開（OpenSource），以促進技術(shù)的應(yīng)用和推廣。我們也期待與有興趣的同行和機構(gòu)進一步交流和合作，基于ATOPlex技術(shù)平臺開發(fā)其他病原微生物的檢測和溯源方案。

編譯：王雨，博士研究生，昆士蘭大學

第一作者：倪高風，博士后研究員，昆士蘭大學

通訊作者：郭建華，副教授，昆士蘭大學

昆士蘭大學AWMC團隊成員：盧際，Nova Maulani，王志堯，袁志國，胡氏虎

華大團隊成員：田巍、楊林、楊碧澄、Ivon Harliwong

昆士蘭大學QAEHS成員：Jochen Mueller

原文鏈接

Ni, G., Lu, J., Maulani, N., Tian, W., Yang, L., Harliwong,I., Wang, Z., Mueller, J., Yang, B., Yuan, Z., Hu, S., & Guo, J. （2021）. Novel Multiplexed Amplicon-Based Sequencing to Quantify SARS-CoV-2 RNA from Wastewater. Environmental Science & Technology Letters. https://doi.org/10.1021/acs.estlett.1c00408

昆士蘭大學水管理高等研究中心昆士蘭大學水管理高等研究中心(Advanced Water Management Centre，AWMC，http://www.awmc.uq.edu.au) 成立于1996年，是目前國際公認的頂尖水處理技術(shù)創(chuàng)新中心之一。

中心位于昆士蘭大學圣盧西亞校區(qū)，擁有800平方米的辦公及實驗面積和1000多萬澳元的儀器設(shè)備， 主要致力于利用微生物學、過程工程學、化學及數(shù)學等手段進行污水處理、水回收利用及廢物資源化的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究工作。水管理高等研究中心主要包括水-健康-環(huán)境關(guān)系，城市綜合水管理，智能城市水系統(tǒng)，下水道管網(wǎng)腐蝕與臭味控制，新一代污水處理技術(shù)開發(fā)，農(nóng)業(yè)資源回收，環(huán)境生物技術(shù)開發(fā)，環(huán)境-能源-碳網(wǎng)絡(luò)，甲烷的生物轉(zhuǎn)化等九大研究領(lǐng)域。

華大智造ATOPlex平臺

ATOPlex多重PCR定制化平臺是華大智造自主研發(fā)的以超高重PCR技術(shù)為核心的產(chǎn)品定制平臺。該平臺涵蓋了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可提供科研、醫(yī)藥、司法、農(nóng)業(yè)、DTC等相關(guān)領(lǐng)域的個性化基因檢測產(chǎn)品定制。

該平臺涵蓋了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可提供科研、醫(yī)藥、司法、農(nóng)業(yè)、DTC等相關(guān)領(lǐng)域的個性化基因檢測產(chǎn)品定制。