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去探索，基因組的真實世界 | 華大智造MGIEasy PCR-Free DNA文庫制備試劑套裝正式亮相

時間：2019-05-16作者：華大智造

在5月10日結(jié)束的MDx 2019-第五屆中國先進分子診斷技術(shù)與應(yīng)用論壇上，華大智造應(yīng)邀舉行專場衛(wèi)星會，面向國內(nèi)市場正式發(fā)布了重磅新品：MGIEasy PCR-Free DNA文庫制備試劑套裝。這一發(fā)布，在現(xiàn)場引起了業(yè)內(nèi)專業(yè)人士的廣泛關(guān)注。

這款產(chǎn)品歷時兩年研發(fā)，是基于華大智造MGISEQ系列測序平臺，首款不需要進行PCR擴增的全基因組文庫制備試劑，廣泛兼容包括人、動植物、細(xì)菌、宏基因組等多種樣本類型，具有起始量低、覆蓋均一性好、檢測變異性能強大、檢測成本低等優(yōu)勢，將為探索真實的基因組世界提供強大動力。

蒙在真實世界上的面紗——復(fù)制錯誤累積

目前在NGS測序中，經(jīng)常使用PCR技術(shù)進行DNA模板擴增及文庫信號放大，但是PCR擴增中產(chǎn)生的錯誤積累造成了信息失真，如堿基置換、假SNPs和InDels、覆蓋不均一、數(shù)據(jù)GC偏向性等問題，不能完全反應(yīng)原始模板基因組的真實面貌。

為避免建庫中的復(fù)制錯誤，2009年出現(xiàn)了最早的PCR-free建庫方法，但事實上在后續(xù)的文庫放大過程中，市場上主流的測序儀，仍舊使用指數(shù)擴增的PCR方法來放大文庫，并沒有從根本上解決測序之前的文庫復(fù)制錯誤累積問題。

雙劍合一打開基因組的真實世界：PCR-free+ DNBSEQ^TM

因此，要探索真實的基因組信息，需要在建庫和文庫放大（以增強測序信號強度）兩個環(huán)節(jié)去除PCR過程，以避免引入復(fù)制錯誤。

華大智造的MGISEQTM平臺系列測序儀采用滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）技術(shù)，只以最初的單鏈環(huán)狀文庫為模板進行線性擴增，整個過程的克隆錯誤率低至1/105，即使某個循環(huán)出現(xiàn)了擴增錯誤，也不會被累積到下一個循環(huán)，經(jīng)過幾百個循環(huán)的擴增之后，擴增產(chǎn)物形成像毛線團一樣的DNA納米球（DNB）。測序時這些納米球被加載到點狀高密度微陣列測序芯片上，芯片上一個點捕獲一個納米球，整個加載過程無PCR指數(shù)擴增體系，保證了測序前的放大文庫保留更準(zhǔn)確的基因組原始信息，這種技術(shù)稱為DNBSEQTM技術(shù)。

在DNBSEQ^TM技術(shù)基礎(chǔ)上，將無擴增錯誤的PCR-free單鏈環(huán)狀文庫建庫方法與無拷貝錯誤累積的DNB制備方法結(jié)合起來，實現(xiàn)真正的全基因組PCR-free測序，打開基因組的真實世界。

經(jīng)過華大智造的不斷優(yōu)化和改進，我們研發(fā)出了基于DNBSEQTM測序平臺的MGIEasy PCR-Free 試劑套裝。

MGI Easy PCR-Free試劑產(chǎn)品分為物理法和酶切法兩種套裝，分別適用于物理打斷法和酶切打斷法建庫，兩種PCR-free方法的建庫時間相比傳統(tǒng)方法均有所縮減，物理法從打斷片段選擇DNA開始3.5小時完成建庫，酶切法從基因組DNA開始4.5小時完成建庫。

左圖：MGIEasy PCR-Free DNA 文庫制備試劑套裝

右圖：MGIEasy 酶切PCR-Free DNA 文庫制備試劑套裝

性能優(yōu)異的MGIEasy PCR-Free試劑

1、更低起始量

相比PCR方法，PCR-free接頭連接效率由37%提升至58%，DNA起始量由最低1500ng降至最低500ng。

2、無明顯GC偏好

以3種不同GC菌基因組DNA為模板，用兩種試劑盒構(gòu)建文庫上機。從GC bias分析作圖來看，高GC菌和低GC菌與中GC菌一樣，通過算法均一化的100bp窗口GC含量分布頻率（圖中用藍(lán)色點狀線表示）都接近理想值1.0這條線。

3、更好的基因組覆蓋均一性

利用MGIEasy PCR-Free DNA文庫與MGIEasy DNA文庫的對比實驗，以1μg 人標(biāo)準(zhǔn)品NA12878起始，物理打斷，采用MGIEasy PCR-Free DNA文庫制備試劑套裝和傳統(tǒng)WGS PCR方法分別建庫，然后基于MGISEQ-2000平臺進行 PE150測序，截取30X數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果顯示，同傳統(tǒng)的WGS PCR相比較，WGS PCR-free的測序深度頻率分布（左圖，紅色柱狀圖）更趨接近于泊松分布的理想的測序深度頻率（左圖，藍(lán)色線狀圖），說明WGS PCR-free的測序數(shù)據(jù)具有更好的基因組覆蓋均一性。另外需要特別指出，MGIEasy PCR-Free DNA文庫 duplication

rate一般在1-3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他測序平臺（7-10%），下機數(shù)據(jù)利用率高。

WGS PCR-Free和WGS PCR測序深度頻率分布圖

圖釋：X軸，表示測序深度；Y軸，表示測序深度頻率分布，代表某一深度占所有深度的百分比。紅色柱狀圖表示實際情況下的占比；藍(lán)色線狀圖表示理想情況下的占比。

在特殊區(qū)域的研究方面，PCR-free更具有優(yōu)勢。比如FMR1基因5’UTR區(qū)域CGG重復(fù)序列的過渡表達(dá)，會導(dǎo)致X脆性綜合征，該區(qū)域?qū)儆贑GG重復(fù)區(qū)域，傳統(tǒng)的WGS在該區(qū)域的覆蓋度不好，難以通過傳統(tǒng)的WGS方法進行檢測。而PCR-Free可以很好的覆蓋到這個區(qū)域，可以實現(xiàn)FMR1基因的CGG重復(fù)序列的WGS檢測。

4、優(yōu)異的變異檢測性能

海外第三方數(shù)據(jù)分析公司評估顯示，以30x截取數(shù)據(jù)為例，在MGISEQ-2000平臺上，MGIEsay PCR-Free的真陽性個數(shù)相對更高，假陽性和假陰性個數(shù)相對更少，靈敏度和準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于PCR。InDel F score大于99%，SNP F score 大于99.9%，已經(jīng)滿足FDA全基因組測序評估金標(biāo)準(zhǔn)，因此更適合于臨床樣本的檢測。

此外該公司數(shù)據(jù)還顯示，15x的MGIEasy PCR-Free的InDel檢測性能已經(jīng)能達(dá)到PCR方法下30x相同水平，SNP的檢測性能高于99%。這個結(jié)果顯示，在一些中低深度（10-20x）的WGS研究中，PCR-free也可以實現(xiàn)優(yōu)秀的變異檢測性能。