RNA是生物學(xué)分子機(jī)理研究中不可避免需要使用到的研究對(duì)象。細(xì)胞內(nèi)的RNA蘊(yùn)含著豐富的信息，包括序列、豐度、結(jié)構(gòu)等。由于RNA表達(dá)具有時(shí)間和空間的特異性，樣本獲取難度較大，取材后樣本中RNA的精準(zhǔn)分析顯得尤其重要。華大智造目前已發(fā)布四款基于MGI測(cè)序平臺(tái)的RNA建庫(kù)試劑盒，本次將重點(diǎn)介紹MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑盒。

目前主要的RNA研究策略包括轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（mRNA），長(zhǎng)鏈非編碼RNA測(cè)序（lncRNA），小RNA測(cè)序(small RNA)和環(huán)狀RNA測(cè)序（circRNA）等。華大智造已發(fā)布四款基于DNBSEQTM技術(shù)并與MGI測(cè)序平臺(tái)適配的RNA建庫(kù)試劑盒（表1）用于實(shí)現(xiàn)RNA的系統(tǒng)化研究。

前期我們已介紹了MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑盒（可點(diǎn)擊此鏈接或文末鏈接查看）[劉致恒(zhihe1] ，本期著重介紹MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑盒。對(duì)比常規(guī)RNA分析，方向性RNA測(cè)序分析在構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)時(shí)，將RNA鏈的方向信息保存到文庫(kù)中，測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析可確定轉(zhuǎn)錄本是來(lái)自正義還是反義DNA鏈，這一方法更能準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量和確定基因的結(jié)構(gòu)，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)錄本以及更多新的基因，是研究基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控的重要手段。簡(jiǎn)單的說(shuō)，RNA方向性轉(zhuǎn)錄組測(cè)序就是高階版本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，能夠幫助生物狗更加精準(zhǔn)分析基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)信息。

那么MGIEasyRNA方向性文庫(kù)制備試劑套裝的表現(xiàn)究竟如何呢？讓我們一一道來(lái)。

1.起始量可低至10ng

圖1（左） 不同起始量PCR產(chǎn)量     圖2（中） 不同起始量比對(duì)率     圖3（右） 不同起始量基因檢出數(shù)

用商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)品UHRR（Universal Human Reference RNA，Agilent，740000）進(jìn)行測(cè)試，total RNA投入量分別為10ng，50ng，200ng和1μg，OligodT磁珠釣取polyA RNA后，采用MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑套裝建庫(kù)，結(jié)果顯示，文庫(kù)產(chǎn)量與1ug達(dá)到同等水平，基因比對(duì)率達(dá)到60%左右和基因檢出數(shù)接近20000個(gè)，不同起始量不存在顯著差異。即使當(dāng)投入量低至10ng時(shí)，本試劑盒保持穩(wěn)定高質(zhì)量數(shù)據(jù)產(chǎn)出，能夠解決生物狗珍貴樣本分析的老大難問(wèn)題，使得即使只有10ng total RNA的珍貴樣本也依然可以保持高質(zhì)量數(shù)據(jù)產(chǎn)出。

2. 基因表達(dá)定量精準(zhǔn)，重復(fù)性好

同樣是UHRR釣取polyA RNA后，采用MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑套裝構(gòu)建庫(kù)，結(jié)果分析顯示，在基因定量準(zhǔn)確性上，MGIEasy RNA方向性文庫(kù)與qPCR的一致性為0.86，與MGIEasy RNA文庫(kù)（采用MGIEasy RNA文庫(kù)制備試劑套裝建庫(kù)）的定量一致性達(dá)0.99以上，三次樣本測(cè)試重復(fù)性可達(dá)到0.99以上。

圖4（左） MGIEasy RNA方向性試劑盒與qPCR定量一致性  圖5（ 右）MGIEasy RNA方向性文庫(kù)與MGIEasy RNA文庫(kù)定量一致性

3. RNA結(jié)構(gòu)分析更直接可靠

MGIEasyRNA方向性文庫(kù)制備套裝在結(jié)構(gòu)分析上到底有哪些優(yōu)勢(shì)呢？首先是能準(zhǔn)確定向RNA轉(zhuǎn)錄的方向，如圖6所示，MGIEasyRNA方向性文庫(kù)檢測(cè)到正鏈的比例可以達(dá)99%。

圖6 RNA方向性試劑盒與RNA試劑盒的正鏈比例

由于MGIEasy RNA方向性文庫(kù)能夠定位RNA轉(zhuǎn)錄的方向，所以在相同Reads深度的覆蓋下，MGIEasy RNA方向性文庫(kù)能更準(zhǔn)確的確定Junction形成的位點(diǎn)，對(duì)于轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)檢測(cè)及變異分析更有助益。

圖7 RNA方向性試劑盒相比RNA試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

4. 更完美的基因覆蓋度

與I平臺(tái)的同類(lèi)型主流試劑盒的文庫(kù)數(shù)據(jù)相比，MGIEasy RNA方向性文庫(kù)具有更完美的基因覆蓋度，能均勻覆蓋基因5’端到3’端（圖8），那么在轉(zhuǎn)錄本組裝等方面就具有更多優(yōu)勢(shì)。RNA方向性試劑盒不僅在結(jié)構(gòu)分析和基因表達(dá)定量分析上的雙重優(yōu)勢(shì)，而且讓基因檢測(cè)更準(zhǔn)確。

圖8 RNA方向性試劑盒與I平臺(tái)的主流試劑盒的均一性比較

RNA方向性試劑盒在基因結(jié)構(gòu)分析和基因表達(dá)定量分析上的雙重優(yōu)勢(shì)，讓基因檢測(cè)更準(zhǔn)確。

當(dāng)然，我們也不能只看MGISEQ平臺(tái)上比較數(shù)據(jù)，為了分析不同測(cè)序平臺(tái)之間是否存在顯著性差異，我們也進(jìn)行了I平臺(tái)的主流試劑盒（N和K）數(shù)據(jù)一致性分析，結(jié)果顯示與N試劑盒的一致性為0.95，與K試劑盒的一致性為0.98（圖9）。整體上來(lái)說(shuō)平臺(tái)之間，不同試劑盒之間具有可比性。

圖9 RNA方向性試劑盒與I平臺(tái)的主流試劑盒的一致性

下面快速總結(jié)一下華大智造不同試劑盒以及使用范圍，提供給各位生物狗們選擇，讓大家不要為了寶貴樣本數(shù)據(jù)產(chǎn)出發(fā)愁。

以上試劑盒中，rRNA去除試劑盒是一款高效的RNA富集試劑盒，能有效去除rRNA，保留mRNA，lncRNA和circRNA。另外一種常見(jiàn)的RNA富集方法，是通過(guò)OligodT磁珠釣取具有polyA尾巴的mRNA和部分lncRNA，這種方法已有很多成熟的商用試劑盒。Total RNA樣本經(jīng)上述任一種富集方法處理后，即可結(jié)合MGIEasyRNA文庫(kù)制備試劑盒套裝或MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑盒套裝進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。

此外，關(guān)于small RNA文庫(kù)制備試劑盒介紹請(qǐng)點(diǎn)擊這里，這個(gè)可是華大智造測(cè)序平臺(tái)上的王牌應(yīng)用之一，在超過(guò)100篇文章中已經(jīng)被驗(yàn)證和使用。

最后，奉上MGIEasy RNA方向性文庫(kù)制備試劑盒實(shí)際數(shù)據(jù)供測(cè)評(píng)練手，請(qǐng)戳這里→

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048125/CNR0066420/

ftp://ftp.cngb.org/pub/CNSA/CNP0000288/CNS0040524/CNX0048127/CNR0066422/

參考文獻(xiàn)：

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[2] Kallen A N, Zhou X B, Xu J, et al. The imprinted H19 lncRNAantagonizes let-7 microRNAs[J]. Molecular cell, 2013, 52(1): 101-112.

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