2013年世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）成立高通量測序（HTS）、生物信息學(xué)和計算基因組學(xué)（BCG）特設(shè)小組，2016年該小組發(fā)布了首個在獸醫(yī)學(xué)中應(yīng)用高通量測序技術(shù)的通用標(biāo)準(zhǔn)1并收錄于《陸生動物疫苗和診斷手冊》。10年后的今天，高通量測序技術(shù)已發(fā)展得相當(dāng)成熟，國產(chǎn)高通量測序平臺愈發(fā)經(jīng)濟和便捷，大大加快了該技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)中的使用。

圖1 《陸生動物疫苗和診斷手冊》第1.1.7 章提到的高通量測序的應(yīng)用方向1

華大智造DNBSEQ測序平臺已在畜禽疾病診斷、疫病監(jiān)測、致病機理研究、耐藥性分析等相關(guān)工作中得到應(yīng)用，給獸醫(yī)臨床工作帶來了重要提升與改善。現(xiàn)將相關(guān)應(yīng)用案例總結(jié)如下，以幫助獸醫(yī)工作者了解高通量測序技術(shù)，更好地利用該技術(shù)改善動物疫病的診斷、控制和管理。

我國畜禽養(yǎng)殖場動物疫病呈現(xiàn)多發(fā)、混合感染狀態(tài)，快速、全面、準(zhǔn)確地鑒定病原體是及時制定有效防控措施、減少疾病傳播和損失的關(guān)鍵2。傳統(tǒng)檢測方法往往針對單一靶標(biāo)或3-4個多重靶標(biāo)進行檢測，在進行批量樣本、多病原檢測時，操作復(fù)雜、耗時長、綜合成本較高。

靶向測序通常用于檢測與臨床疾病相關(guān)的已知病原體，單次檢測靶標(biāo)數(shù)量遠大于PCR方法，獲取的信息更多。除了鑒定病原，還能表征其特點耐藥、毒力基因、分型、區(qū)分疫苗株/野生株等特點，非常適合混合感染及綜合征的檢測3。

圖2 ATOPlex單管超高重PCR技術(shù)特點與原理

華大智造推出病原微生物靶向測序產(chǎn)品組合，基于ATOPlex多重PCR技術(shù)開發(fā)了靶向測序Panel，搭配華大智造DNBSEQ測序平臺和分析軟件，實現(xiàn)從樣本到報告的全流程支持，具有數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)異、基因組覆蓋全、自動化程度高等特點，為病原微生物的監(jiān)測與溯源提供強大工具。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院王少林教授基于華大智造病原微生物靶向測序產(chǎn)品組合開發(fā)了豬呼吸道病原體靶向測序Panel。此Panel針對常見的引起豬呼吸道感染的15種病原體（7種病毒、4種細菌、4種其他病原體）的多個保守區(qū)域靶標(biāo)基因開發(fā)而成，覆蓋病原種類豐富，特異性好，適用于鼻拭子、咽拭子、血液血清及組織樣本。

圖3 采用豬呼吸道靶向panel對豬場真實樣本的檢測結(jié)果

針對有呼吸道感染癥狀的豬，單次檢測可以有效檢出豬藍耳病病毒、圓環(huán)病毒、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體等多病原混合感染。

細菌耐藥性日益成為全球關(guān)注的重大健康威脅，遏制抗生素耐藥性需要聯(lián)合人類、動物、環(huán)境衛(wèi)生和其他相關(guān)學(xué)科和部門的專家共同參與。近年來由于抗菌藥物的不合理使用，動物源耐藥菌/耐藥基因廣泛流行與傳播，養(yǎng)殖環(huán)境已成為耐藥菌/耐藥基因的主要貯庫與來源之一。

王少林教授團隊基于華大智造病原微生物靶向測序產(chǎn)品組合同時開發(fā)了耐藥基因多重擴增子測序Panel4。此Panel針對278種抗生素耐藥基因、重金屬耐藥基因以及遺傳移動元件設(shè)計了超多重擴增子，可以同時檢測上千個耐藥基因及其變異體，適用于極低起始量樣本。相比宏基因組測序方法，靶向測序能夠檢出更多靶標(biāo)基因。對于一些豐度較低的耐藥基因，靶向測序靈敏度更高，同時能以較低的測序成本實現(xiàn)靶標(biāo)基因測序深度的顯著提高與高覆蓋率。

圖4 奶牛養(yǎng)殖場耐藥基因多重擴增子檢測及細菌分錄驗證結(jié)果

利用耐藥基因多重擴增子測序方法，研究者對多個奶牛養(yǎng)殖場的健康、患病個體，以及糞便、土壤、墊料等環(huán)境樣本進行了調(diào)查。通過檢測，在環(huán)境樣本中發(fā)現(xiàn)了多種抗生素耐藥基因，主要包括β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因、AmpC頭孢菌素酶耐藥基因、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因和碳青霉烯類耐藥基因。進一步驗證發(fā)現(xiàn)，5個奶牛場中健康奶樣、臨床乳房炎樣品中均檢測到β-內(nèi)酰胺酶，環(huán)境和皮膚拭子樣本中均分離到產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌，與環(huán)境樣本中檢測到β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的結(jié)果一致，據(jù)此推測原奶樣本中的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶可能來源于環(huán)境中的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌。因此需要更加關(guān)注環(huán)境中的耐藥菌可能帶來的食品安全的問題。

監(jiān)測預(yù)警體系是應(yīng)對突發(fā)疫情防控的基礎(chǔ)，隨著非洲豬瘟、新型冠狀病毒肺炎和新發(fā)人獸共患病的出現(xiàn)，全球現(xiàn)有的動物疫病監(jiān)測預(yù)警體系面臨新的挑戰(zhàn)。相比傳統(tǒng)的分子基因分型方法，如多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）等，全基因組測序（WGS）技術(shù)獲得的疫病信息更加全面，通過從基因組水平對分離株之間的單核苷酸變化或多態(tài)性進行分析，識別高度相似甚至相同的分離株，以確定爆發(fā)源和追蹤傳播。

圖5  2018年8月3日至9月2日中國境內(nèi)非洲豬瘟病毒感染農(nóng)場的位置圖及ASFV 基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系5

非洲豬瘟病毒于2018年8月傳入中國，在短短幾個月內(nèi)迅速擴散至全國，至2019年7月底，全國31個省份暴發(fā)非洲豬瘟疫情150起，其中家豬暴發(fā)146起，野豬暴發(fā)4起，對全國生豬養(yǎng)殖造成極大破壞。獲取在中國流行的非洲豬瘟病毒株的全基因組序列并深入研究其特征，對疫情控制、疫苗研發(fā)意義重大。

中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心研究人員基于華大智造DNBSEQ測序平臺，對直接從現(xiàn)場樣本中分離的China/2018/AnhuiXCGQ非洲豬瘟毒株進行了全基因組測序，獲得了該毒株基因組的完整編碼序列區(qū)，并進行了深入的基因組變異分析。

基因組序列比對分析顯示，China/2018/AnhuiXCGQ毒株與其他基因型II強毒株之間存在54-107個變異位點，導(dǎo)致10-38個基因中氨基酸殘基的表達或改變。China/2018/AnhuiXCGQ毒株與POL/2015/Podlaskie毒株具有最高的相似性。基于125kb長的保守中心區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，China/2018/AnhuiXCGQ毒株和四個歐洲基因型II菌株被分為三個集群。這項研究為非洲豬瘟病毒的進化提供了重要信息，也為疫苗和診斷試驗的開發(fā)提供了基本信息。

高通量測序技術(shù)作為一種研究工具已經(jīng)在獸醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用，并且正在逐步被納入獸醫(yī)診斷實驗室，但作為獸醫(yī)診斷工具大規(guī)模使用，仍需要完善多方面的工作。如：面對不同場景選擇全基因組、宏基因組和靶向測序等不同方法。測序?qū)嶒炇冶仨氃谫|(zhì)量體系下運作，并對指定用途的測試進行系統(tǒng)驗證，計算分析的靈敏度和特異性、準(zhǔn)確度、精確度和檢測限。需要合適的專家對序列數(shù)據(jù)進行分析3。數(shù)據(jù)的解讀應(yīng)由具有適當(dāng)資格的獸醫(yī)主導(dǎo)，并符合動物疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn)要求等1。

圖6 華大智造MGI iLab智惠實驗室

華大智造提供MGI iLab智惠實驗室，覆蓋從樣本存儲及前處理、文庫構(gòu)建與高通量測序、數(shù)據(jù)分析儲存以及全流程閉環(huán)管理，為您的獸醫(yī)測序?qū)嶒炇姨峁?biāo)準(zhǔn)化、模塊化、自動化、信息化、智能化的平臺工具支撐。

【參考文獻】

1. CHAPTER 1.1.7.STANDARDS FOR HIGH THROUGHPUTSEQUENCING, BIOINFORMATICS AND COMPUTATIONAL GENOMICS.

2. WU G，WEI J T，ZHANG Y X，et al． Application of the high－throughput sequencing technology in veterinary clinical practice ［J］．Animal Husbandry ＆Veterinary Medicine，2021，53 ( 1)?: 130－135．

3. Wilkes, R. P. Next-Generation Diagnostics for Pathogens.Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 39, 165–173 (2023).

4. Li, Y. et al. Multiplexed Target Enrichment Enables Efficient and In-Depth Analysis of Antimicrobial Resistome in Metagenomes. Microbiol Spectr 10, e02297-22 (2022).

5. Bao, J. et al. Genome comparison of African swine fever virus China/2018/Anhui XCGQ strain and related European p72 Genotype II strains. Transbound Emerg Dis 66, 1167–1176 (2019).